Summary
Анализ МТТ является простым и воспроизводимым колориметрического анализа для оценки жизнеспособности клеток, основанный на уменьшении желтого МТТ и производство нерастворимые в воде фиолетовый формазана. Здесь, жизнеспособность MCF-7 клеток при лечении nanogenomedicine была оценена.
Abstract
Цитотоксичность футуристический nanogenomedicine (например, коротких интерферирующих РНК и антисмысловых), могут помешать его клинической разработки. Из них ген медицины и / или ее носитель может вызывать сотовой токсичности. Для оценки таких цитотоксичность, общая методология во многом зависит от использования 3 - (4, 5-диметил-2-тиазолил) -2, 5-дифенил-2H-тетразолия бромид (МТТ) анализа, который широко используется в качестве колориметрического подхода, основанного на активности митохондриальных ферментов дегидрогеназы в клетках. В нынешней расследования, MCF-7 клеток были привиты в 96-луночного планшета и при 50% слияния с ними обращались с различными nanopolyplexes и подвергается МТТ анализ после 24 часов. Водорастворимые желтого МТТ метаболизируется метаболически активных клеток в нерастворимые в воде фиолетовый формазана, который далее растворяется в буфере рН диметилсульфоксида и Sornson с 10,5. Полученный продукт может быть определена количественно спектрофотометрически использованием ридер при 570 нм.
Protocol
MCF-7 посева в 96-луночного планшета:
MCF-7 клетки культивировали в 25 т-колбу в среде, содержащей Средний Дульбеко изменения Орла (DMEM), 10% ЭТС, 100 ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина при 37 ° C с 5% CO 2, 95% воздух и полное влажности. Как только достигли ~ 90% слияния, они были отделены использованием 0,05% трипсин / ЭДТА и рассчитывал с помощью трипанового синий и гемоцитометра. Эти клетки затем ресуспендировали в концентрации 4 × 10 4 клеток / см 2 и дополнен 96-луночного планшета (т.е., 250 мкл / лунку) на 8-канальная пипетка. Для фона поглощения, некоторые скважины остались бесклеточных, то есть как пустые контроля.
Лечение клеток с разными nanopolyplexes:
На 40-50% слияния (48 ч после посева), культивируемые клетки обрабатывали наноструктурированных звездообразования полиамидоамин дендримеров (т.е. Superfect ® и Polyfect ®) и роман полимера испытание, после трансфекции инструкции предоставляемые поставщиком. Клетки также рассматривается с EGFR и омлет антисмысловых в одиночку, и с трех разных nanopolyplexes этих двух олигонуклеотидов и с полимерами (п = 4). Четыре скважины остались необработанными в качестве контроля. Через 4 часа лечения СМИ были удалены, и пополняется свежей информации.
МТТ-тест для оценки жизнеспособности клеток:
МТТ анализ был выполнен через 24 часа после трансфекции. С этой целью МТТ решения был подготовлен на 1mg/ml в ФБР и фильтруют через фильтр 0,2 мкм. Затем, 50 мкл МТТ плюс 200 мкл DMEM без фенола красного были добавлены в каждую лунку, за исключением бесклеточной пустой скважины. Клетки инкубировали в течение 4 часов при температуре 37 ° C с 5% CO 2, 95% воздуха и полное влажности. После 4 часов раствор МТТ был удален и заменен 200 мкл ДМСО и 25 мкл Соренсона глицин буфере (0,1 М глицин, NaCl 0,1 М, рН: 10,5 с 0,1 NaOH). Пластины дальнейшего инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре и оптической плотности (ОП) скважин определялась с помощью ридер на тест длине волны 570 нм и референтной длине волны 630 нм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Анализ МТТ считается универсальным методом и, соответственно, жизнеспособность клетки могут быть оценены на различных методов лечения. Производство результирующая формазана, как представляется, пропорционально уровню энергетического обмена в клетках. Таким образом, можно измерить метаболически активированных клеток даже в отсутствие клеточной пролиферации. Количество формазана производится пропорционально количеству МТТ в среде инкубации. В то время как концентрация МТТ, которая требуется для достижения максимального количества формазана производства может измениться при использовании различных клеточных линий. Кроме того, воспользовавшись этой анализа, очень небольшое количество живых клеток могут быть обнаружены и частота ошибок будет минимальным, поскольку нет необходимости промывки. Поглощение формазана варьируется в зависимости от количества клеток, а также рН, которые могут быть преодолены с добавлением буфера при рН 10,5 1. Цвет формазана стабилен в течение нескольких часов при комнатной температуре 2. В случае более одной пластины, контроль должен быть включен в другие плиты, а также. Тем не менее, этот метод страдает от некоторых незначительных недостатков:) метаболически неактивные клетки не могут подвергаться дискриминации с мертвыми клетками 3, б) МТТ решения должны быть защищены от света, хотя она может храниться при температуре 4 ° С не более одного месяца, 2, в) не выполняет проверку стабильности препарата в среде, и г) клетки, используемые для МТТ не может быть впоследствии использована для других анализов.
Он должен вызывать, что фенол красный поглощает при 570 нм. Кроме того, ранее сообщалось, что фенол красный обладает эстроген деятельности, которые могут повлиять на картину клеточного роста в течение нескольких эстрогена реагировать клетки, последующие неточные результаты МТТ. Чтобы избежать такого воздействия, мы использовали DMEM без фенола красного 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Авторы хотели бы выразить признательность стволовых клеток и технологии Шахид Гази Тебриз компаний, соответственно, для обеспечения DMEM без фенола красного и стерильной воды для инъекций в качестве подарков.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25 t-flask | Orange Scientific | 5510100 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | P3813 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose | Sigma-Aldrich | D5671 | |
| MTT | Sigma-Aldrich | M2128 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Penicillin 200,000 u/ml | CinnaGen | CR7913 | |
| Streptomycin 200 mg/ml | CinnaGen | CR7912 | |
| trypsin/EDTA | Sigma-Aldrich | T3924 | |
| trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Superfect | Qiagen | 301105 | |
| Polyfect | Qiagen | 301305 | |
| EGFR antisense | Eurofins MWG Operon | ||
| Scrambled antisense | Eurofins MWG Operon | ||
| DMEM without phenol red | GIBCO, by Life Technologies | 11880 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| hemocytometer | HBG | ||
| 8-channel pipette | TreffLab Transferpette | 96.9918.10.1 | |
| Disposable syringe filter | Iwaki, Asahi Techno Glass Corp. | 2052-025 | |
| Plate reader equipped with 570 nm &630 nm filters | BioTek | ELX808 | |
| 96-well plate with lid (flat bottom) | Iwaki, Asahi Techno Glass Corp. | 3860-096 | |
| Laminar flow hood | Esco Products | ||
| CO2 Incubator | ASTEC |
References
- Plumb, J. A., Milroy, R., Kaye, S. B. Effects of the pH Dependence of 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium Bromide-Formazan Absorption on Chemosensitivity Determined by a Novel Tetrazolium-based Assay. Cancer Research. 49, 4435-4435 (1989).
- Mosmann, T. Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival: Application to Proliferation and Cytotoxicity Assays. Journal of Lmmunological Methods. 65, 55-55 (1983).
- Yang, M. Energy and Redox States in the C6 Glioma Cells Following Acute Exposure to Zn, Se +4 , and Se +6 and the Correlation with Apoptosis. Toxicology Mechanisms and Methods. 16 (1), 13-13 (2006).
- Spinner, D. M. MTT Growth Assays in Ovarian Cancer, in Ovarian Cancer: Methods and Protocols. Bartlett, J. M. S. , Humana Press, Inc. 175-177 (2000).
