Summary
El ensayo de MTT es un ensayo colorimétrico fácil y reproducible para la evaluación de la viabilidad celular basado en la reducción de MTT amarilla y la producción de agua morada formazán insoluble. En este caso, la viabilidad de las células MCF-7 sobre el tratamiento de nanogenomedicine ha sido evaluada.
Abstract
Citotoxicidad de los nanogenomedicine futurista (por ejemplo, corto de interferencia de ARN antisentido y) puede obstaculizar su desarrollo clínico. De ellos, la medicina basada en genes y / o su compañía pueden provocar toxicidad celular. Para la evaluación de la citotoxicidad como, una metodología común depende en gran medida la utilización de la 3 - (4, 5-dimetil-2-tiazolil) -2, 5-difenil-2H-tetrazolio (MTT) de ensayo que ha sido ampliamente utilizado como un enfoque colorimétrico basado en la actividad de las enzimas deshidrogenasa mitocondrial de las células. En esta investigación actual, células MCF-7 fueron inoculadas en placa de 96 pocillos y en la confluencia del 50% fueron tratados con nanopolyplexes diferentes y sometidos a ensayo MTT después de 24 horas. Agua amarilla MTT soluble es metabolizado por las células metabólicamente activas para el agua insoluble formazán púrpura, que se ve disuelta en buffer de pH dimetilsulfóxido y Sornson s 10,5. El producto resultante puede ser cuantificado por espectrofotometría utilizando un lector de placas a 570 nm.
Protocol
MCF-7 de siembra en placa de 96 pocillos:
MCF-7 células fueron cultivadas en 25 t-matraz en un medio que contiene Dulbecco Modificado Medio Eagle (DMEM), 10% de SFB, 100 penicilina U / ml, y 100 estreptomicina mg / ml a 37 ° C con 5% CO2, 95% aire y la humedad total. Una vez llegado a 90% de confluencia, se separaron con 0,05% de tripsina / EDTA y se cuentan por medio de azul de tripano y un hemocitómetro. Estas células se resuspendieron luego en una concentración de 4 × 10 4 células / cm 2, y añadió en placa de 96 pocillos (es decir, 250 l / pocillo) por una pipeta de 8 canales. Para la absorción de fondo, algunos pozos se mantuvo libre de células, es decir, como el control en blanco.
El tratamiento de células con nanopolyplexes diferentes:
A 40-50% de confluencia (48 horas después de la siembra), las células cultivadas fueron tratadas con dendrímeros nanoestructurados estelar poliamidoamina (es decir, ® y ® Superfect Polyfect) y un polímero prueba novela siguiendo las instrucciones de transfección proporcionada por los proveedores. Las células fueron tratadas también con EGFR y revueltos antisentido solo, y con los tres nanopolyplexes diferentes de estos dos oligonucleótidos y con polímeros (n = 4). Cuatro pozos se quedó sin tratar como control. Después de 4 horas los medios de comunicación el tratamiento fueron retirados y se repone con medio fresco.
MTT ensayo para evaluar la viabilidad de las células:
MTT ensayo se llevó a cabo 24 horas después de la transfección. Para ello, la solución de MTT se ha preparado a 1mg/ml en PBS y se filtró a través de un filtro de 0,2 micras. Entonces, 50 l de MTT más 200 l de DMEM sin rojo fenol se añadieron a cada pocillo, con excepción de los pozos en blanco libre de células. Las células fueron incubadas durante 4 horas a 37 º C con CO2 al 5%, 95% de aire y la humedad total. Después de 4 horas, la solución de MTT fue removido y reemplazado con 200 l de DMSO y glicina 25μl Sorenson buffer (glicina 0,1 M, NaCl 0,1 M, pH: 10,5 a 0,1 NaOH). La placa se incubó durante 5 min a temperatura ambiente, y la densidad óptica (DO) de los pozos se determinó usando un lector de placas a una longitud de onda de prueba de 570 nm y una longitud de onda de referencia de 630 nm.
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Discussion
El ensayo de MTT se considera que es un método versátil y, en consecuencia la viabilidad de las células podrían ser evaluados en diversos tratamientos. La producción de formazán resultante parece ser proporcional al nivel de metabolismo de la energía en las células. Por lo tanto, es posible medir las células metabólicamente activa, incluso en ausencia de la proliferación celular. La cantidad de formazán producida es proporcional a la cantidad de MTT en el medio de incubación. Mientras, la concentración de MTT que se requiere para alcanzar la cantidad máxima de formazán producida puede cambiar sobre la utilización de líneas celulares diferentes. Además, de haber utilizado este ensayo, número muy pequeño de las células vivas pueden ser detectados y la incidencia de los errores sería mínimo ya que no hay necesidad de pasos de lavado. La absorción de formazán varía con el número de células, así como el pH, que podría ser superado con la adición de tampón a pH 10.5 1. El color de formazán es estable durante un par de horas a temperatura ambiente 2. En el caso de más de una placa, los controles deben ser incluidos en otros platos también. Sin embargo, este método adolece de algunos inconvenientes menores: a) las células metabólicamente inactiva no puede ser objeto de discriminación con las células muertas de 3, b) solución de MTT debe ser protegido de la luz a pesar de que podría ser almacenadas a 4 ° C durante un máximo de un mes a 2, c) que no puede validar la estabilidad del fármaco en el medio, y d) las células utilizan para MTT no pueden ser utilizados posteriormente por cualquier otros ensayos.
Debe ser evocado que el rojo fenol absorbe a 570 nm. Además, se ha informado anteriormente de que el rojo fenol posee la actividad del estrógeno, que puede afectar el patrón de crecimiento de las células dentro de algunas células de estrógeno respuesta, siguió resultados imprecisos MTT. Para evitar este impacto, hemos utilizado DMEM sin rojo fenol 4.
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Acknowledgments
Los autores desean agradecer a la tecnología de células madre y Shahid empresas Ghazi Tabriz, respectivamente, para proveer de agua DMEM sin rojo fenol y estéril para inyección como regalos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25 t-flask | Orange Scientific | 5510100 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | P3813 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose | Sigma-Aldrich | D5671 | |
| MTT | Sigma-Aldrich | M2128 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Penicillin 200,000 u/ml | CinnaGen | CR7913 | |
| Streptomycin 200 mg/ml | CinnaGen | CR7912 | |
| trypsin/EDTA | Sigma-Aldrich | T3924 | |
| trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Superfect | Qiagen | 301105 | |
| Polyfect | Qiagen | 301305 | |
| EGFR antisense | Eurofins MWG Operon | ||
| Scrambled antisense | Eurofins MWG Operon | ||
| DMEM without phenol red | GIBCO, by Life Technologies | 11880 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| hemocytometer | HBG | ||
| 8-channel pipette | TreffLab Transferpette | 96.9918.10.1 | |
| Disposable syringe filter | Iwaki, Asahi Techno Glass Corp. | 2052-025 | |
| Plate reader equipped with 570 nm &630 nm filters | BioTek | ELX808 | |
| 96-well plate with lid (flat bottom) | Iwaki, Asahi Techno Glass Corp. | 3860-096 | |
| Laminar flow hood | Esco Products | ||
| CO2 Incubator | ASTEC |
References
- Plumb, J. A., Milroy, R., Kaye, S. B. Effects of the pH Dependence of 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium Bromide-Formazan Absorption on Chemosensitivity Determined by a Novel Tetrazolium-based Assay. Cancer Research. 49, 4435-4435 (1989).
- Mosmann, T. Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival: Application to Proliferation and Cytotoxicity Assays. Journal of Lmmunological Methods. 65, 55-55 (1983).
- Yang, M. Energy and Redox States in the C6 Glioma Cells Following Acute Exposure to Zn, Se +4 , and Se +6 and the Correlation with Apoptosis. Toxicology Mechanisms and Methods. 16 (1), 13-13 (2006).
- Spinner, D. M. MTT Growth Assays in Ovarian Cancer, in Ovarian Cancer: Methods and Protocols. Bartlett, J. M. S. , Humana Press, Inc. 175-177 (2000).
