Summary
MTT testi sarı MTT azaltılması ve suda çözünmeyen mor formazan üretimine dayalı hücre canlılığının değerlendirilmesi için kolay ve tekrarlanabilir kolorimetrik assay. Burada, nanogenomedicine tedavi üzerine MCF-7 hücre canlılığı değerlendirildi.
Abstract
Fütüristik nanogenomedicine (örneğin, kısa müdahale RNA ve antisens) Sitotoksisite klinik geliştirme engel olabilir. Bunlardan, gen bazlı ilaç ve / veya taşıyıcı hücresel toksisite ortaya çıkarmak. Gibi sitotoksisite değerlendirilmesi için ortak bir metodoloji, 3 kullanımı üzerine büyük ölçüde bağlıdır (4, 5-dimetil-2-thiazolyl) -2, yaygın olarak kullanılan 5-difenil-2H-tetrazolium bromide (MTT) tayini hücrelerinde mitokondriyal dehidrogenaz enzimlerin aktivitesi üzerine dayalı bir kolorimetrik yaklaşım. Bu araştırmada, MCF-7 hücreleri 96-plaka ekildi ve 50% confluency farklı nanopolyplexes ile tedavi edildi ve 24 saat sonra tahlil MTT için tabi. Suda çözünen sarı MTT dimethylsülfoksit ve Sornson s tampon pH 10,5 daha fazla çözünmüş suda çözünmeyen mor formazan, metabolik olarak aktif hücreler tarafından metabolize edilir. Ortaya çıkan ürün, 570 nm'de bir plaka okuyucu kullanarak spektrofotometri tarafından belirlenebilir.
Protocol
MCF-7 96-plaka tohumlama:
MCF-7 hücreleri 37 ° Dulbecco'nun Modifiye Kartal Kullanıcı Orta (DMEM),% 10 FBS, 100 U / ml penisilin, ve 100 mg / ml streptomisin içeren orta 25 t-balon kültüre edildi ° C'de% 5 CO 2,% 95 ile hava ve tam nem. Bir kez ~% 90 confluency ulaştı, 0.05% tripsin / EDTA ile müstakil ve tripan mavi ve hemasitometre sayılır. Bu hücreler daha sonra 4 × 10 4 hücre / cm 2 'lik bir konsantrasyon yeniden bekletildi ve 8 kanallı pipet tarafından (yani, 250 ul / kuyu) 96 plaka üzerine eklendi. Arka plan emilimi için bazı kuyuların boş kontrol olarak hücre, yani kaldı.
Farklı nanopolyplexes ile hücreler Tedavisi:
% 40-50 az confluency (48 saat tohumlama), kültür hücreleri nanoyapılı dolup taşan polyamidoamine dendrimers (yani, Superfect ® ve Polyfect ®) ve tedarikçi tarafından sağlanan transfeksiyon talimat aşağıdaki bir roman test polimer ile tedavi edildi. Hücreler aynı zamanda EGFR tedavi ve yalnız antisens şifreli ve bu iki oligonükleotidler üç farklı nanopolyplexes ve polimerler (n = 4) idi. Dört kuyuların kontrolü gibi tedavi edilmezse kaldı. 4 saat sonra tedavi medya çıkarıldı ve taze medya ile doldurulmaktadır.
Hücre canlılığını değerlendirmek için MTT assay:
MTT assay transfeksiyon 24 saat sonra yapıldı. Bu amaçla, MTT çözüm PBS içinde 1mg/ml hazırlanan ve 0,2 mikron filtre ile filtre edilmiştir. Sonra, MTT artı fenol kırmızısı olmadan DMEM 200 ul ul 50 hücre boş kuyular hariç, her bir kuyunun içine ilave edildi. Hücreler 37 az 4 saat süreyle inkübe edildi ° C,% 5 CO 2,% 95 hava ve nem tam. 4 saat sonra, MTT çözüm kaldırılır ve DMSO ve 25μl Sorenson glisin tamponu (glisin 0.1M NaCl 0.1M, pH: 10.5 0.1 NaOH ile) 200 ul ile değiştirilir. Plaka daha fazla oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edildi ve kuyuların optik yoğunluk (OD), 570 nm test dalga boyu ve 630 nm referans dalga boyu bir plaka okuyucu kullanılarak tespit edildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MTT testi, çok yönlü bir yöntem olarak kabul edilir ve buna göre çeşitli tedaviler üzerine hücrelerin canlılığı değerlendirilebilir. Sonuç formazan üretimi, hücrelerde enerji metabolizması düzeyi ile orantılı olarak görünür. Bu nedenle, metabolik olarak aktif hücrelerin hücre proliferasyonu yokluğunda bile ölçmek mümkündür. Üretilen formazan miktarı inkübasyon orta MTT miktarı ile doğru orantılıdır. Ederken, formazan maksimum miktarını elde etmek için gerekli olan MTT konsantrasyonu farklı hücre hatlarının kullanımı üzerine değişebilir. Ayrıca, bu testte kullanılan, çok az sayıda canlı hücreler tespit edilebilir ve çamaşır adımlar için gerek yoktur, çünkü hataların sıklığı az olacaktır. Formazan emilimi pH 10,5 1 tampon ilavesi ile aşılabileceğine hücre sayısı yanı sıra pH ile değişir. Formazan rengi 2 oda sıcaklığında bir kaç saat boyunca stabildir. Birden fazla plaka durumda, kontrol de diğer plakalar dahil edilmelidir. Bununla birlikte, bu yöntem bazı küçük dezavantajları uğrar: bir) metabolik olarak aktif olmayan hücreler ölü hücreleri 3, b ayrımcılık olarak değil.) Bu en fazla bir ay 2 4 ° C de saklanan olması olabilir olsa bile MTT çözüm, ışıktan korumalı olması gerektiğini c) orta ilaç istikrar doğrulamak için başarısız olur ve d) MTT için kullanılan hücre daha sonra başka bir deneyleri için kullanılan olamaz.
Fenol kırmızı, 570 nm'de emer uyarılmış olmalıdır. Ayrıca, daha önce fenol kırmızısı içinde, kesin olmayan MTT sonuçlarını takip eden bazı östrojen duyarlı hücreleri, hücre büyümesi desen etkileyebilir östrojen aktivitesi sahip olduğu rapor edilmiştir. Böyle bir çarpışmayı önlemek için, fenol kırmızısı 4 olmadan DMEM kullanılmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Yazarlar, hediye olarak enjeksiyon için fenol kırmızısı ve steril su olmadan DMEM sağlamak için sırasıyla Kök Hücre Teknolojisi ve Shahid Gazi Tebriz şirketlerinin kabul etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25 t-flask | Orange Scientific | 5510100 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | P3813 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose | Sigma-Aldrich | D5671 | |
| MTT | Sigma-Aldrich | M2128 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Penicillin 200,000 u/ml | CinnaGen | CR7913 | |
| Streptomycin 200 mg/ml | CinnaGen | CR7912 | |
| trypsin/EDTA | Sigma-Aldrich | T3924 | |
| trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Superfect | Qiagen | 301105 | |
| Polyfect | Qiagen | 301305 | |
| EGFR antisense | Eurofins MWG Operon | ||
| Scrambled antisense | Eurofins MWG Operon | ||
| DMEM without phenol red | GIBCO, by Life Technologies | 11880 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| hemocytometer | HBG | ||
| 8-channel pipette | TreffLab Transferpette | 96.9918.10.1 | |
| Disposable syringe filter | Iwaki, Asahi Techno Glass Corp. | 2052-025 | |
| Plate reader equipped with 570 nm &630 nm filters | BioTek | ELX808 | |
| 96-well plate with lid (flat bottom) | Iwaki, Asahi Techno Glass Corp. | 3860-096 | |
| Laminar flow hood | Esco Products | ||
| CO2 Incubator | ASTEC |
References
- Plumb, J. A., Milroy, R., Kaye, S. B. Effects of the pH Dependence of 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium Bromide-Formazan Absorption on Chemosensitivity Determined by a Novel Tetrazolium-based Assay. Cancer Research. 49, 4435-4435 (1989).
- Mosmann, T. Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival: Application to Proliferation and Cytotoxicity Assays. Journal of Lmmunological Methods. 65, 55-55 (1983).
- Yang, M. Energy and Redox States in the C6 Glioma Cells Following Acute Exposure to Zn, Se +4 , and Se +6 and the Correlation with Apoptosis. Toxicology Mechanisms and Methods. 16 (1), 13-13 (2006).
- Spinner, D. M. MTT Growth Assays in Ovarian Cancer, in Ovarian Cancer: Methods and Protocols. Bartlett, J. M. S. , Humana Press, Inc. 175-177 (2000).
