Summary
Il test MTT è un test semplice e riproducibile colorimetrici per la valutazione della vitalità cellulare basato sulla riduzione di MTT giallo e produzione di formazan insolubili in acqua viola. Qui, la vitalità delle cellule MCF-7 dopo il trattamento di nanogenomedicine è stata valutata.
Abstract
Citotossicità della nanogenomedicine futuristico (per esempio, a breve RNA interferente e antisenso) può ostacolare il suo sviluppo clinico. Di questi, il gene-based medicine e / oi suoi vettore può provocare la tossicità cellulare. Per la valutazione della citotossicità tale, una metodologia comune dipende in gran parte l'utilizzo del 3 - (4, 5-dimetil-2-tiazolil) -2, 5-difenil-2H-tetrazolio bromuro (MTT) che è stato ampiamente utilizzato come un approccio colorimetrico basato su l'attività degli enzimi deidrogenasi mitocondriale nelle cellule. In questa inchiesta, cellule MCF-7 sono stati inoculati in piastra a 96 pozzetti e al 50% confluenza sono stati trattati con nanopolyplexes diversi e sottoposti a test MTT dopo 24 ore. MTT solubile in acqua gialla viene metabolizzato dalle cellule metabolicamente attivo alla insolubile in acqua viola formazan, che viene ulteriormente disciolto in tampone pH dimetilsolfossido e Sornson s 10.5. Il prodotto risultante può essere quantificata con spettrofotometria utilizzando un lettore di piastre a 570 nm.
Protocol
MCF-7 semina in piastra a 96 pozzetti:
Cellule MCF-7 sono state coltivate in 25 t-pallone in mezzo contenente Media Dulbecco Modified Eagle (DMEM), 10% FBS, 100 U / ml penicillina e 100 mg / ml di streptomicina a 37 ° C con 5% di CO 2, 95% aria e umidità completo. Una volta raggiunto il ~ 90% di confluenza, sono stati staccati con 0,05% tripsina / EDTA e contati per mezzo di trypan blu e emocitometro. Queste cellule sono state poi risospese ad una concentrazione di 4 × 10 4 cellule / cm 2 e adattata a 96 pozzetti (cioè 250 microlitri / pozzetto) da una pipetta ad 8 canali. Per l'assorbimento del fondo, alcuni pozzi erano rimasti privi di cellule, cioè come controllo in bianco.
Trattando le cellule con nanopolyplexes diverse:
Alla confluenza del 40-50% (48 ore dopo la semina), le cellule coltivate sono state trattate con dendrimeri nanostrutturati polyamidoamine starburst (cioè Superfect ® e Polyfect ®) e un polimero romanzo di prova seguendo le istruzioni fornite dal fornitore trasfezione. Le cellule sono state anche trattate con EGFR e strapazzate antisenso da solo, e con i tre nanopolyplexes diverse di questi due oligonucleotidi e con polimeri (n = 4). Quattro pozzi erano rimasti non trattati come controllo. Dopo 4 ore i mezzi di trattamento sono stati rimossi e sostituire i supporti freschi.
MTT test per valutare la vitalità cellulare:
Saggio MTT è stata eseguita 24 ore dopo la trasfezione. A tal fine, la soluzione di MTT è stato preparato a 1mg/ml in PBS ed è stato filtrato attraverso un filtro 0,2 micron. Poi, 50 ml di MTT più 200 ml di DMEM senza rosso fenolo sono stati aggiunti in ogni pozzetto, ad eccezione del bianco privo di cellule. Le cellule sono state incubate per 4 ore a 37 ° C con 5% di CO 2, 95% di aria e umidità completa. Dopo 4 ore, la soluzione MTT è stato rimosso e sostituito con 200 ml di DMSO e 25μl Sorenson tampone glicina (glicina 0,1 M, NaCl 0,1 M, pH: 10,5 con 0,1 NaOH). La piastra è stata ulteriormente incubate per 5 minuti a temperatura ambiente, e la densità ottica (DO) dei pozzi è stato determinato utilizzando un lettore di piastre di prova alla lunghezza d'onda di 570 nm e una lunghezza d'onda di riferimento di 630 nm.
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Discussion
Il test MTT è considerato un metodo versatile e di conseguenza la vitalità delle cellule potrebbe essere valutato su vari trattamenti. La produzione di formazan risultante sembra essere proporzionale al livello del metabolismo energetico nelle cellule. Pertanto, è possibile misurare le cellule metabolicamente attiva anche in assenza della proliferazione cellulare. La quantità di formazan prodotta è proporzionale alla quantità di MTT nel mezzo di incubazione. Mentre, la concentrazione di MTT che è necessario per ottenere massima quantità di prodotto possono cambiare formazan su utilizzo di diverse linee cellulari. Inoltre, avendo usato questo test, numero molto piccolo di cellule viventi potrebbero essere rilevato e l'incidenza degli errori sarebbero minimi, poiché non vi è alcuna necessità di fasi di lavaggio. L'assorbimento di formazan varia con numero di cellulare così come il pH, che potrebbero essere superati con l'aggiunta di tampone a pH 10.5 1. Il colore del formazan è stabile per un paio d'ore a temperatura ambiente 2. Nel caso di più di un piatto, i controlli dovrebbero essere inclusi in altri piatti pure. Tuttavia, questo metodo soffre di alcuni svantaggi minori: a) le cellule metabolicamente inattive non possono essere discriminati con le cellule morte 3, b) soluzione MTT deve essere protetto dalla luce, anche se potrebbe essere conservato a 4 ° C per un massimo di un mese 2, c) non riesce a convalidare la stabilità della droga nel mezzo, e d) le cellule utilizzati a MTT non può essere successivamente utilizzato per qualsiasi altro test.
Va evocato che il rosso fenolo assorbe a 570 nm. Inoltre, è stato riportato in precedenza che il rosso fenolo possiede l'attività degli estrogeni che possono incidere sul modello di crescita delle cellule all'interno di alcune cellule estrogeno reattivo, conseguente MTT risultati imprecisi. Per evitare l'impatto tale, abbiamo utilizzato DMEM senza rosso fenolo 4.
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Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare tecnologia delle cellule staminali e Shahid Ghazi aziende Tabriz, rispettivamente per la fornitura di DMEM senza rosso fenolo e acqua sterile per preparazioni iniettabili come regali.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25 t-flask | Orange Scientific | 5510100 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | P3813 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose | Sigma-Aldrich | D5671 | |
| MTT | Sigma-Aldrich | M2128 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Penicillin 200,000 u/ml | CinnaGen | CR7913 | |
| Streptomycin 200 mg/ml | CinnaGen | CR7912 | |
| trypsin/EDTA | Sigma-Aldrich | T3924 | |
| trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Superfect | Qiagen | 301105 | |
| Polyfect | Qiagen | 301305 | |
| EGFR antisense | Eurofins MWG Operon | ||
| Scrambled antisense | Eurofins MWG Operon | ||
| DMEM without phenol red | GIBCO, by Life Technologies | 11880 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| hemocytometer | HBG | ||
| 8-channel pipette | TreffLab Transferpette | 96.9918.10.1 | |
| Disposable syringe filter | Iwaki, Asahi Techno Glass Corp. | 2052-025 | |
| Plate reader equipped with 570 nm &630 nm filters | BioTek | ELX808 | |
| 96-well plate with lid (flat bottom) | Iwaki, Asahi Techno Glass Corp. | 3860-096 | |
| Laminar flow hood | Esco Products | ||
| CO2 Incubator | ASTEC |
References
- Plumb, J. A., Milroy, R., Kaye, S. B. Effects of the pH Dependence of 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium Bromide-Formazan Absorption on Chemosensitivity Determined by a Novel Tetrazolium-based Assay. Cancer Research. 49, 4435-4435 (1989).
- Mosmann, T. Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival: Application to Proliferation and Cytotoxicity Assays. Journal of Lmmunological Methods. 65, 55-55 (1983).
- Yang, M. Energy and Redox States in the C6 Glioma Cells Following Acute Exposure to Zn, Se +4 , and Se +6 and the Correlation with Apoptosis. Toxicology Mechanisms and Methods. 16 (1), 13-13 (2006).
- Spinner, D. M. MTT Growth Assays in Ovarian Cancer, in Ovarian Cancer: Methods and Protocols. Bartlett, J. M. S. , Humana Press, Inc. 175-177 (2000).
