Durata pannello misura replicazione in lievito

Summary

In questo articolo vi presentiamo un protocollo generale per misurare la durata della vita di replicazione delle cellule di lievito madre.

Abstract

L'invecchiamento è un processo degenerativo caratterizzato da un progressivo deterioramento delle componenti cellulari e gli organelli con conseguente mortalità. Il lievito in erba

Protocol

Parte 1: Preparare i ceppi e le piastre per l'analisi del ciclo di vita replicativa

Questa sezione descrive la preparazione delle lastre solide YEPD per l'uso nella sperimentazione durata replicativa vita e la preparazione di cellule di lievito per l'analisi durata della vita.

1. Utilizzando opportuni tecnica sterile, preparare piastre di agar YEPD (1 estratto di lievito%, 2% bacto-peptone, 2% agar, 2% di glucosio) che verrà utilizzato per la coltura e le cellule di lievito per l'analisi durata replicativo. Si dovrebbe preparare almeno 2 piastre per ogni 4-5 ceppi da analizzare nell'esperimento durata della vita. Piastre devono essere preparate almeno 2 giorni prima dell'esperimento durata della vita e lasciato asciugare prima di iniziare il saggio durata della vita. Se l'esperimento non sarà avviata entro 4-5 giorni di versare le piastre, devono essere collocati in un incubatore refrigerato e avvolto in parafilm o plastica per evitare essiccazione.
2. Rimuovere ceppi di lievito da scorte congelate e strisciare per singole colonie su piastre di agar YEPD. Fino a 6 ceppi possono essere facilmente striature sulla stessa piastra YEPD suddividendo il piatto in uguali dimensioni torta a forma di cunei.
3. Incubare le cellule a 30 ° C per 2 giorni.
4. Rimuovere le cellule dal termostato e le cellule patch da una singola colonia su un piatto fresco YEPD. Due patch da due colonie diverse deve essere generato per ogni ceppo. A questo punto, i ceppi da analizzare deve essere codificato per garantire la vita esperimento replicativo durata viene effettuato "alla cieca", dove il dissettori non conoscono l'identità dei singoli ceppi.
5. Incubare le patch, le cellule codificati a 30 ° C fino alla sera successiva.
6. Rimuovere le cellule e leggermente cellule patch da ogni ceppo codificato a fresco piatti YEPD, che servirà come le piastre sperimentali utilizzati per l'analisi durata replicativa vita. Le cellule devono essere patchato lungo una linea verticale sul lato sinistro del piatto YEPD (Figura 1). Circa 3-5 patch per ciascuna piastra è ottimale, assumendo vita analisi replicativa durata di 20 celle da ogni patch. Non è necessario (né auspicabile) per trasferire un gran numero di cellule al piatto fresco YEPD, come questo farà sì che le cellule a crescere abbondantemente durante la notte di incubazione, che può limitare la loro durata di vita successive replicativo.
7. Incubare le piastre appena patchato durante la notte sulla cima panchina.

Parte 2: le cellule di posizione per l'analisi del ciclo di vita replicativa.

In questa sezione viene descritto come posizionare le cellule di lievito sul piatto e come ottenere cellule figlie vergini per l'analisi del ciclo di vita replicativa. Da questo punto in poi, tutte le lastre devono essere parafilmed, tranne quando sottoposti a dissezione, per evitare essiccazione.

1. Utilizzando un microscopio dotato di un apparato adatto per microdissezione lievito, il trasferimento di circa 50 cellule dal ceppo prima patch ad una posizione sul piatto distale alle cellule patch. Se il vostro stadio è classificato microscopio, queste gradazioni possono essere utilizzate per garantire le cellule saranno facili da trovare durante le iterazioni successive. Sul Axioscope Zeiss 40, le cellule del ceppo prima patch può essere posizionato in corrispondenza delle coordinate 90 x 10 e disposte in verticale da lì.
2. Pulire l'ago di cellule ripetutamente di toccare la superficie di agar, quindi creare un buco nel agar forzando l'ago attraverso la superficie di agar. Questo buco servirà come marcatore orientativa sul piatto durante iterazioni successive della dissezione e la rimozione delle cellule figlie. Fare attenzione a non ottenere cellule di lievito nel foro, o saranno crescere e formare una colonia.
3. Direttamente sopra il foro, allineare verticalmente singole cellule di lievito in 20 punti distribuiti uniformemente, con diametri di aghi 1-3 (~ 100 mM) tra ogni posizione delle cellule (Figura 1). Ogni poche cellule, luogo due celle adiacenti gli uni agli altri nella stessa posizione nella linea piuttosto che uno. Questo consente la ridondanza durante la selezione della cellula figlia vergine, se una delle celle trasferite non riesce a dividere.
4. Tra ^il 10 e 11 ^° posizione in prima linea, creare una serie orizzontale di 7-8 fori nella agar. Questo servirà come marcatore orientativa sul piatto durante iterazioni successive della dissezione e la rimozione delle cellule figlie. Fare attenzione a non ottenere cellule di lievito nei fori, o saranno crescere e formare una colonia.
5. Ripetere i passaggi 2,1-2,4 per ogni patch sul piatto, continuando a celle di serie verticalmente lungo l'asse stesso. Per il passaggio 2.2, il numero di fori creati deve corrispondere al numero di patch (una buca per la prima patch, due fori per il secondo, ecc.)
6. Una volta che le cellule sono stati schierati per ogni patch, parafilm la piastra e incubare a 30 ° C per circa 2 ore.
7. Ripetere i passaggi 2,1-2,6 per ogni piastra nell'esperimento.

Parte 3: Ottenere cellule figlie vergini per l'analisi durata della vita

In questa sezione abbiamo iniziato l'analisi durata della vita facendo in modo che ogni cellula inizia come una figlia verginecell.

1. Rimuovere le piastre dal termostato e verificare che la maggior parte delle cellule schierati hanno subito una divisione cellulare. Se è necessario ulteriore tempo per consentire la divisione cellulare per essere completato, riportare la piastra per l'incubatore.
2. A partire dalla prima cella schierati, utilizzare l'ago a staccarsi cellule figlie dalla cellula madre con delicatezza mettendo l'ago sulla parte superiore delle celle collegate. A volte è utile per toccare il lato della base microscopio mentre l'ago è appoggiato sulle cellule.
3. Posizionare il cellulare staccato figlia in linea verticale, sostituendo la cellula madre e le cellule figlie aggiuntivi e spostarli temporaneamente da parte.
4. Ripetere il punto 3.2 e 3.3 per ognuna delle celle in serie. Se una cellula non riesce a dividere, prendere una cellula figlia da una delle celle ridondanti posizionato al punto 2.3. Al termine, si dovrebbe avere 20 cellule figlie per ogni patch allineati verticalmente sulla piastra di vita.
5. Raccogliere tutte le cellule madri e cellule figlie in più in un mucchio e trasferire di nuovo a una zona vicino le patch ("il cimitero"). E 'importante mantenere le cellule indesiderate lontano dalle cellule in fase di analisi durata di vita per prevenire la formazione di microcolonie e l'esaurimento delle sostanze nutritive locale.
6. Parafilm la piastra e incubare a 30 ° C per circa 2 ore.
7. Ripetere i passaggi 3,2-3,6 per ogni piastra nell'esperimento.

Parte 4: misura la capacità replicativa delle singole cellule

1. Preparare i dati di durata fogli. Una vita scheda può essere una semplice griglia dove ogni riga corrisponde ad una cellula madre individuo e ogni colonna corrisponde ad una età-punto (Figura 2). Etichetta ogni scheda in base al numero di ceppi da analizzare.
2. Rimuovere le piastre dal termostato e verificare che la maggior parte delle cellule schierati hanno subito almeno una divisione cellulare. Se è necessario ulteriore tempo per consentire la divisione cellulare per essere completato, riportare la piastra per l'incubatore.
3. A partire dalla prima cella schierati sul piatto prima, visivamente osservare la cellula madre e figlia (s) e determinare il numero di divisioni cellulari che si sono verificati. In genere è facile determinare il numero di cellule figlie di una madre ha prodotto, sulla base di modelli caratteristici di accordi cellulare. Registrare il numero di cellule figlie prodotte dalla cellula madre nella apposita casella sulla scheda di valutazione durata della vita.
4. Utilizzare l'ago a staccarsi cellule figlie dalla cellula madre come descritto al punto 3.2.
5. Conservare la cellula madre nella sua posizione nella linea verticale e spostare la cellula figlia (s) a temporaneamente da parte.
6. Ripetere i passaggi 4,3-4,5 per ciascuna delle cellule schierati.
7. Raccogli tutte le cellule figlie scartato e spostarli al 'cimitero', che si trova nei pressi della patch originale.
8. Parafilm la piastra e incubare a 30 ° C per 2-3 ore.
9. Ripetere i passaggi 4,3-4,8 per ogni piastra nell'esperimento.
10. Ripetere i passaggi 4,2-4,9 fino a quando tutte le cellule madre hanno smesso di dividersi. Come l'età della madre cellule, la progressione del ciclo cellulare diventa più lento e sarà auspicabile incubare la piastra per lunghi periodi di tempo tra età-punti. Piastre possono essere posizionati a 4 ° C durante la notte.

Parte 5: Risultati Rappresentante.

I dati grezzi prodotti da un esperimento durata replicativa vita è un elenco di numeri corrispondenti alle cellule figlie prodotte da ogni cellula madre ad ogni età-punto (Figura 2). Sommando ogni riga del foglio di punteggio, la durata della vita di replicazione per ogni cellula madre si ottiene. Dati per le cellule madre dello stesso gruppo sperimentale possono essere raggruppati per generare una curva di sopravvivenza (Figura 3A) e di eseguire calcoli statistici, come la durata della vita media, la durata della vita media e deviazione standard. Un test non parametrico, come il rank-sum test di Wilcoxon, possono essere eseguite per determinare se le differenze significative nella durata della vita sono stati individuati tra i gruppi sperimentali. Quando l'esperimento funziona correttamente, la curva di sopravvivenza dovrebbero essere grosso modo in linea con Gompertz-Makeham cinetica che mostra un shap sigmoidale con bassa mortalità precoce seguì un declino relativamente rapido in termini di sopravvivenza e un appiattimento della curva uno epoche successive. La maggior parte dei ceppi wild-type hanno replicativa valori di durata della vita nel range 20-30 generazione, anche se al di fuori di questo intervallo di variazione è stato riportato.

Figura 1. Schema di un tipico piatto vita replicativa. La sera prima dell'inizio microdissezione di cellule di lievito, 3-5 ceppi sono leggermente patchato sulla superficie di una piastra YEPD (box rosso) in una linea verticale lungo un lato della piastra. Dopo una crescita durante la notte, circa 30 celle singole da ogni ceppo sono disposte verticalmente in una linea contenente 20 posizioni. Durata della vita l'analisi dells sarà eseguita su v cellule figlie vergini ottenuti da queste cellule iniziali. Extra cellule ottenute da microdissezione durante l'esperimento (ad esempio cellule figlie indesiderate) sono collocati nel "cimitero" (ovale grigio), che si trova lontano dalle celle sperimentali in modo da evitare l'esaurimento locale di sostanze nutritive come colonie sono formate.

Figura 2. Una vita replicativa foglio durata riscontro. I dati grezzi da un esperimento durata replicativa vita è mostrato. Ogni riga corrisponde ad una singola cellula di lievito madre e ogni colonna corrisponde ad una età-point. Il numero inserito in ogni casella è il numero di cellule figlie prodotte da quella cellula madre a quell'età-point. Ogni sforzo è etichettato con un numero codificato in modo tale che l'individuo dissezionare le cellule di lievito non è a conoscenza dell'identità dei ceppi analizzati. Venti cellule sono analizzati per ogni ceppo.

Figura 3. Rappresentante sopravvivenza e curve di crescita di un esperimento durata replicativa vita. (A) Le curve di sopravvivenza sono ottenuta riportando la frazione di cellule madre ancora in vita in funzione di età replicativa (numero di divisioni cellulari. (B) le curve di crescita sono ottenuta riportando la numero medio di cellule figlie prodotto da un ceppo dato in funzione di età-point. In questo esempio, ceppo # 2 è a lungo vissuto, ma è più lenta crescita, come dimostra la pendenza ridotta iniziale della trama di crescita.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Reagent	Fisher Scientific	DF0145-17-0 (214530)
Bacto-Peptone	Reagent	Fisher Scientific	DF0118-17-0 (211677)
Yeast Extract	Reagent	Fisher Scientific	DF0886-17-0 (288620)
Glucose