Диапазона измерений репликативной Жизнь в почкующихся дрожжей

Summary

В этой статье мы представляем общий протокол для измерения диапазона репликативной жизни клеток дрожжей матери.

Abstract

Старение является дегенеративный процесс характеризуется прогрессирующей деградации клеточных компонентов и органелл в результате чего смертность. Почкующихся дрожжей

Protocol

Часть 1: Подготовка штаммов и пластины для анализа репликативной продолжительности жизни

В этом разделе описывается подготовка твердых YEPD пластин для использования в пролете репликативной эксперимент жизни и подготовке дрожжевых клеток для анализа жизненного диапазона.

1. Использование соответствующего метода стерильных, подготовить YEPD пластин агар (1% дрожжевой экстракт, 2% Бакто-пептон, 2% агара, 2% глюкозы), который будет использоваться для клеток культивирования дрожжей и анализ репликативной продолжительности жизни. Вы должны подготовить по крайней мере 2 пластины для каждые 4-5 штаммы, которые будут проанализированы в эксперименте продолжительность жизни. Плиты должны быть готовы по крайней мере за 2 дня до эксперимента продолжительности жизни и дают высохнуть перед началом анализа жизни. Если эксперимент не будет начат в течение 4-5 дней заливки плит, они должны быть помещены в инкубатор охлажденном и завернутые в парафильмом или пластиковые для предотвращения высыхания.
2. Удалить штаммов дрожжей из замороженных запасов и для отжима отдельных колоний на YEPD пластин агара. До 6 штаммы могут быть легко прожилками на одной пластине YEPD путем разделения пластины в одинаковых по размеру пирога форму клиньев.
3. Инкубируйте клетки при 30 ° С в течение 2 дней.
4. Удалить клетки из инкубатора и патч-клетки из одной колонии на свежем YEPD пластины. Два патчи от двух разных колониях должны быть созданы для каждого штамма. В это время штаммы, которые будут проанализированы должны быть закодированы, чтобы обеспечить пролет репликативной жизни эксперимент проводится "слепым", где диссекторы не знаю идентичности отдельных штаммов.
5. Инкубируйте в заплатах, закодированные клетки при 30 ° С до следующего вечера.
6. Удалить клетки и клетки слегка патч от каждого закодирован напряжение на свежий YEPD пластины, которые будут служить экспериментальной пластины, используемые для анализа промежуток жизни репликативной. Клетки должны быть исправлены по вертикальной линии на левой стороне YEPD пластины (рис. 1). Примерно 3-5 патчей на чашку является оптимальным, предполагая репликативной жизни анализ на 20 ячеек от каждого патча. Это не обязательно (и нежелательно) для передачи большого количества клеток, чтобы свежие YEPD пластины, так как это приведет к клеткам расти густо во время инкубации в течение ночи, что может ограничить их последующей продолжительность жизни репликативной.
7. Инкубируйте недавно пропатчен пластин ночь на скамейке наверху.

Часть 2: Должность клеток для анализа репликативной продолжительности жизни.

В этом разделе мы опишем, как положение дрожжевых клеток на тарелку и как получить девственной дочерних клеток для анализа репликативной продолжительности жизни. С этого момента, все пластины должны быть parafilmed, кроме случаев, когда проходит вскрытие, во избежание высыхания.

1. Использование микроскопа, снабженного микродиссекции аппарат, пригодный для дрожжей, передача около 50 клеток из первых пропатчен напрягаться, чтобы положение на пластине дистальнее пропатчен клеток. Если ваш столик микроскопа оценивается, эти градации могут быть использованы для обеспечения клетки можно будет легко найти в ходе последующих итераций. На Axioscope Zeiss 40, клетки из первого исправления деформации может быть размещен в точке с координатами 90 х 10 и выстроил вертикально оттуда.
2. Чистая игла клеток, неоднократно касаясь поверхности агара, а затем создать дыру в агар, заставляя иглу через поверхность агара. Это отверстие будет служить в качестве маркера для сориентировать вас на тарелке в ходе последующих итераций рассечение и удаление дочерней клетки. Будьте осторожны, чтобы не получить дрожжевых клеток в дыру, или они будут расти и формировать колонии.
3. Прямо над отверстием, вертикального выравнивания индивидуальные клетки дрожжей на 20 равномерно распределены должности, с 1-3 диаметра иглы (~ 100 мкм) между каждой ячейкой положение (рис. 1). Каждые несколько клеток, место две клетки рядом друг с другом в том же положении в линию, а не один. Это позволяет для обеспечения избыточности в девственной выбора ячейки дочь, если один из переданных клетки не в состоянии разрыва.
4. Между ^10-й и ^11-й позиции на линии, создавать горизонтальные серии 7-8 отверстия в агар. Это будет служить в качестве маркера для сориентировать вас на тарелке в ходе последующих итераций рассечение и удаление дочерней клетки. Будьте осторожны, чтобы не получить дрожжевые клетки в отверстия, или они будут расти и формировать колонии.
5. Повторите шаги 2.1-2.4 для каждого пятна на пластине, продолжая массив клетки вертикально вдоль одной оси. Для шага 2.2, количество отверстий создан должна соответствовать патч номер (одно отверстие для первого патча, два отверстия для второй и т. д.).
6. Как только клетки были выстроены для каждого патча, парафильмом пластины и инкубировать при 30 ° С в течение примерно 2 часов.
7. Повторите шаги 2.1-2.6 для каждой пластины в эксперименте.

Часть 3: Получить дева, дочь клеток для анализа жизненного диапазона

В этом разделе мы начинаем анализ продолжительности жизни, гарантируя, что каждая клетка начинает как дочь девственницаклетке.

1. Удалить пластины из инкубатора и убедиться, что большинство из выстроились клетки претерпели деление клеток. Если необходимо дополнительное время, чтобы деление клеток будет завершен, вернитесь пластину инкубатора.
2. Начиная с первых выстроил ячейки, используйте иглу для отсоединения дочерних клеток из материнской клетки, осторожно размещения иглы на вершине прилагается клеток. Иногда бывает полезно выявить стороне микроскопом базу, при этом игла покоится на клетки.
3. Место отдельные ячейки дочь в вертикальную линию, заменив клетка матери и любые дополнительные дочерние клетки и перемещение их временно в стороне.
4. Повторите шаг 3,2 и 3,3 для каждой из выстроились клеток. Если клетка не в состоянии разделить, взять дочерней клетки от одного из избыточных клетки расположены в шаге 2.3. Когда закончите, вы должны иметь 20 дочерних клеток для каждого патча вертикально на тарелке продолжительность жизни.
5. Соберите все материнские клетки и предоставление дополнительных дочерних клеток в кучу и передачи их в области около патчи ("кладбище"). Важно держать нежелательных клеток далеко от клетки проходят анализ продолжительности жизни для предотвращения образования микроколоний и истощения местных питательных веществ.
6. Парафильмом пластины и инкубировать при 30 ° С в течение примерно 2 часов.
7. Повторите шаги 3.2-3.6 для каждой пластины в эксперименте.

Часть 4: Измерение репликативной способности отдельных клетках

1. Подготовка жизни паспорта. Срок службы технической спецификации можно простую сетку, где каждая строка соответствует отдельной клетки матери, а каждый столбец соответствует возрастным точке (рис. 2). На каждом листе данных в зависимости от количества штаммов, которые будут проанализированы.
2. Удалить пластины из инкубатора и убедиться, что большинство из выстроились клетки подверглись по крайней мере одно деление клеток. Если необходимо дополнительное время, чтобы деление клеток будет завершен, вернитесь пластину инкубатора.
3. Начиная с первых выстроил ячейку первой пластинки, визуально наблюдать мать и дочь ячейку (и) и определить число клеточных делений, которые произошли. Как правило, легко определить, сколько дочерние клетки матери, который основан на характерные модели клеточных механизмов. Запись числа дочерних клеток производства материнской клетки в соответствующее поле на счет листа продолжительность жизни.
4. Используйте иглу отделить дочерние клетки от материнской клетки, как описано в пункте 3.2.
5. Сохраните материнской клетки в своей позиции в вертикальную линию и двигаться дочерней клетки (ы), чтобы временно в стороне.
6. Повторите шаги 4.3-4.5 для каждого из выстроились клеток.
7. Соберите все отбрасывается дочерние клетки и перемещать их на "кладбище", расположенный рядом оригинальных патчей.
8. Парафильмом пластины и инкубировать при температуре 30 ° С в течение 2-3 часов.
9. Повторите шаги 4.3-4.8 для каждой пластины в эксперименте.
10. Повторите шаги 4.2-4.9, пока все материнские клетки прекратили делиться. Как возраст матери клеток, прогрессию клеточного цикла становится медленнее, и это будет желательным для инкубации пластина для более длительных периодов времени в возрасте между точками. Плиты могут быть размещены на 4 ° С в течение ночи.

Часть 5: Представитель результаты.

Сырых данных, полученных в эксперименте промежуток жизни репликативной это список чисел, соответствующих дочерних клеток, произведенных каждым материнской клетки на каждом возрастном-точка (рис. 2). Суммируя каждой строке оценка листа, промежуток репликативной жизни для каждой материнской клетке получается. Данные материнские клетки из той же экспериментальной группы могут быть объединены, чтобы создать кривую выживаемости (рис. 3А) и для выполнения статистических расчетов, например, среднюю продолжительность жизни, средняя продолжительность жизни, и стандартное отклонение. Непараметрических тестов, например, Вилкоксона суммы рангов тестов, могут быть выполнены, чтобы определить существенные различия в продолжительности жизни были обнаружены между экспериментальными группами. Когда эксперимент работает правильно, кривая выживаемости должна быть примерно соответствует Гомпертца-Makeham кинетики показывает сигмоидального Шап с низкой ранней смертности следуют сравнительно быстрое снижение выживаемости и уплощение кривой последующих веков. Большинство штаммов дикого типа имеют репликативной жизни значения в 20-30 поколение диапазона, хотя изменения вне этого диапазона не поступало.

Рисунок 1. Типичная схема пластины жизни репликативной. Вечером перед началом микродиссекции клеток дрожжей, 3-5 штаммов слегка пропатчен на поверхность YEPD пластины (красные коробки) в вертикальную линию вдоль одной стороны пластины. После роста на ночь, около 30 отдельных клеток из каждой линии выстраиваются вертикально в строку, содержащую 20 позиций. Продолжительность жизни анаов будет осуществляться на V дева, дочь клеток, полученных из этих первоначальных клеток. Дополнительные клеток, полученных из микродиссекции в ходе эксперимента (например, нежелательные дочерних клеток) находятся в "кладбище" (серый овал), который находится далеко от экспериментальной клетки для того, чтобы избежать местных истощение питательных веществ, образуются колонии.

Рисунок 2. Промежуток репликативной жизни подсчет листа. Необработанные данные из диапазона эксперимент жизни репликативной показано. Каждая строка соответствует одной ячейке мать дрожжей и каждый столбец соответствует возрастной точки. Число, введенное в каждой графе число дочерних клеток, произведенного той материнской клетки в этом возрасте точки. Каждый штамм имеет метку с кодовым число такое, что человек рассекает дрожжевых клеток не имеет сведений о личности штаммов анализируются. Двадцать клетки анализировали на каждого штамма.

Рисунок 3. Представитель выживания и роста кривых из диапазона эксперимент жизни репликативной. () Выживание кривые получены путем построения долю материнские клетки еще живы в зависимости от репликативной возраст (число клеточных делений. (В) Рост кривые получены путем построения Среднее число дочерних клеток производства данного штамма в зависимости от возрастной точки. В этом примере, штамм № 2 долгоживущих но медленнее растет, о чем свидетельствует снижение начальный наклон роста сюжет.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Reagent	Fisher Scientific	DF0145-17-0 (214530)
Bacto-Peptone	Reagent	Fisher Scientific	DF0118-17-0 (211677)
Yeast Extract	Reagent	Fisher Scientific	DF0886-17-0 (288620)
Glucose