In vivo Bioluminescent imagem de tumores mamários Usando Spectrum IVIS

Summary

Células tumorais mamárias expressar luciferase são implantados subcutaneamente em camundongos e visualizado utilizando imagens ópticas para monitorar o crescimento do tumor e de desenvolvimento não-invasiva em um estudo longitudinal.

Abstract

Camundongo 4T1 células tumorais mamárias pode ser implantado sub-cutânea em nu / nu ratos para formar tumores palpáveis ​​em 15 a 20 dias. Este sistema modelo xenoenxerto tumor é valioso para o pré-clínicos na avaliação in vivo de compostos antitumor putativa.

A linhagem celular 4T1 foi projetado para constitutivamente expressam o gene luciferase do firefly (luc2). Quando ratos portadores 4T1-luc2 tumores são injetados com Luciferina os tumores emitir um sinal luminoso visual que pode ser monitorado usando um sistema de imagens ópticas sensíveis como o Spectrum IVIS. O fluxo de fótons a partir do tumor é proporcional ao número de células emissores de luz eo sinal pode ser medido para monitorar o crescimento do tumor e do desenvolvimento. IVIS é calibrado para permitir a quantificação absoluta do sinal bioluminescente e estudos longitudinais podem ser realizadas ao longo de muitos meses e mais de várias ordens de magnitude de sinal, sem comprometer o resultado quantitativo.

O crescimento do tumor pode ser monitorado durante vários dias pela bioluminescência antes do tamanho do tumor se torna palpável ou mensurável por meios físicos tradicionais. Esse monitoramento rápido pode fornecer informações sobre eventos precoces no desenvolvimento do tumor ou levar a menor procedimentos experimentais.

Morte da célula tumoral e necrose devido ao tratamento hipóxia ou medicamento está indicado no início por uma redução no sinal bioluminescente. Esta morte celular pode não ser acompanhada por uma redução no tamanho do tumor medido por meios físicos. A capacidade de ver eventos no início de necrose tumoral tem um impacto significativo sobre a seleção e desenvolvimento de agentes terapêuticos.

Imagens quantitativas do crescimento tumoral utilizando IVIS fornece a quantificação precisa e acelera o processo experimental para gerar resultados.

Protocol

Uma grande variedade de linhagens celulares expressando luciferase câncer pode ser usado para pesquisa pré-clínica em modelos de mouse.

Estas células são fornecidos como uma cultura isentos de agentes patogénicos congelados, que prontamente crescer em mídia padrão sem a necessidade de marcadores de seleção.

Para nosso experimento, usaremos o 4T1-luc2 linhagem de células mamárias murinas tumor, que expressa o gene da luciferase, que serve como um indicador óptico de expressão gênica ou tumorgenesis in vivo. Vamos usar a expressão de luciferase para acompanhar o crescimento do tumor primário não-invasiva, mas eles também podem ser usados ​​para localizar e monitorar as lesões metastáticas.

Atividade de luciferase deve ser verificada antes da injeção, e para fazer isso, um frasco de 90% confluentes é colhido por tripsinização e então contadas.

50.000 células são, então, dispensadas em um único poço de uma placa de microtitulação e diluições seriadas são realizadas. Luciferina é adicionado aos poços em 150ug por ml e incubadas por 2 minutos. A microplaca pode ser trabalhada em IVIS ou um leitor de placas luminescentes para determinar níveis de expressão. Esta linhagem celular expressa até 6500 fótons por célula por segundo, mas qualquer nível de expressão acima de 500 fótons por célula por segundo pode ser trabalhada com sucesso in vivo.

Agora que temos as células de atividade ideal, podemos avançar para a etapa de injeção subcutânea.

A fim de facilitar a detecção do tumor ótima, estamos usando uma cepa do mouse atímicos imunocomprometidos nude. Antes da injeção, os animais são anestesiados para efeito de anestesia profunda.

Em seguida, vamos injetar até 250.000 células em 100ul PBS são injetadas por via subcutânea no flanco. Carregar as células em uma seringa de 1 ml e anexar uma agulha de calibre 26. Levante a pele suavemente com uma pinça para fazer uma "tenda" e injetar as células na base. As células recém-injetado podem ser visualizados imediatamente. Em cada sessão a imagem de um total de 150mg de luciferina por kg de peso corporal é então administrado através de duas injeções na cavidade peritoneal.

Neste estudo, os animais são imaged 10 minutos após a injeção Luciferina para garantir fluxo de fótons consistente. Vamos mostrar isso no próximo passo. Luciferina cinética pode variar de dia para dia. Neste modelo particular, medindo 10 minutos após a injeção Luciferina deu um resultado dentro de uma faixa de variação de 15%.

Para nosso experimento, usaremos o Spectrum IVIS in vivo sistema de imagem usa um back-diluído dispositivo de carga acoplado resfriado a -90 ° C para atingir o máximo de sensibilidade. Para apoiar a quantificação absoluta, o sistema de medidas de carga escuro durante o tempo e executa um auto-calibração durante a inicialização. Para iniciar a imagem, inicializar o sistema IVIS (um clique) e definir os parâmetros de imagem para o experimento.

Selecione o campo de visão para o número de animais com imagens. Até 5 animais podem ser mantidos no instrumento usando as múltiplas integrante anestésico. O palco está em um constante 37 ° C para manter a temperatura corporal nos animais. Uma porta de ECG é fornecido para monitorar a saúde dos animais durante os procedimentos estressantes.

In Living software de imagem, tempo de exposição, f-stop e pixel binning pode ser otimizado com base no nível de expressão da linha celular. Essas configurações podem ser alteradas a qualquer momento durante um experimento sem impactar o resultado quantitativo.

IVIS adquire uma imagem fotográfica do animal sob luz branca e um sinal bioluminescente quantitativa ou fluorescentes, que é sobreposta à imagem.

O sinal bioluminescente é expressa em fótons por segundo e exibido como um mapa da intensidade. A visualização da imagem é ajustado para oferecer melhor contraste e resolução da imagem sem afetar a quantificação.

Luminescência das células pode ser medido no local da injecção com uma região de interesse ferramenta. Dados de medição são exibidos na tabela em conjunto com todos os parâmetros experimentais relacionadas com a captura de imagens que podem ser salvos ou exportados para análise

Várias imagens podem ser adquiridos e comparados em estudos longitudinais que cobrem segundos ou meses, dependendo da natureza do experimento. Vamos medir fluxo de fótons a partir do tumor no tempo zero e monitor para 4 semanas com imagens em intervalos quinzenais.

Photon fluxo do tumor é proporcional ao número de células vivas para expressar luciferase bioluminescência se correlaciona diretamente com o tamanho do tumor.

Em 5 dias após a implantação do tumor ainda não é palpável, mas as células podem ser quantificados através da bioluminescência eo tumor é visto como crescendo ativamente. Nesta fase, o sinal de bioluminescência é muito stronger. O tempo de exposição, f-stop e binning pixel pode ser ajustado para que a imagem é clara ea câmera não saturar. IVIS compensa automaticamente as mudanças na coleta de luz para essas medições podem ser comparados com aqueles coletados antes e depois do experimento.

Aos 7 dias pós-implantação tumores são palpáveis, pela primeira vez e bioluminescência medida já gerou sete dias de dados.

Aos 28 dias pós-implantação, os tumores estão tornando-se necrótico e células começam a morrer. Tamanho do tumor estimado por pinça de medição não se altera significativamente, mas a luminescência do tumor diminui indicando a morte celular.

Medições Caliper e medição da bioluminescência pode ser continuado até uma extremidade humana é atingido. Necrose tumoral devido à hipóxia ou regimes de tratamento será indicado pela bioluminescência reduzido mesmo se eles não reduzem a massa tumoral.