In vivo Bioluminescent Imaging van borsttumoren gebruik van IVIS Spectrum

Summary

Mammatumor cellen die luciferase worden subcutaan geïmplanteerd in muizen en gevisualiseerd met behulp van optische beeldvorming om tumoren groei en ontwikkeling niet-invasief in een longitudinale studie monitor.

Abstract

4T1 muis mammatumor cellen kunnen subcutaan geïmplanteerd worden in nu / nu muizen voelbare tumoren vormen in 15 tot 20 dagen. Dit xenograft tumor model is waardevol voor de pre-klinische in vivo evaluatie van de vermeende antitumor verbindingen.

De 4T1 cellijn is ontworpen om constitutief drukken de vuurvlieg luciferase gen (luc2). Bij de muizen die 4T1-luc2 tumoren worden geïnjecteerd met Luciferine de tumoren geven een visueel licht signaal dat kan worden gecontroleerd met behulp van een gevoelige optische beeldvorming systeem zoals de IVIS Spectrum. Het foton flux van de tumor is evenredig aan het aantal lichtgevende cellen en het signaal kan worden gemeten om tumorgroei en ontwikkeling te volgen. IVIS is gekalibreerd om absolute kwantificering van de lichtgevende signaal en longitudinale studies kunnen worden uitgevoerd gedurende vele maanden en over meerdere orden van grootte het signaal, zonder afbreuk te doen aan het kwantitatieve resultaat.

Groei van de tumor kan worden gecontroleerd op een aantal dagen door bioluminescentie voordat de tumorgrootte tastbaar of meetbaar door de traditionele fysieke middelen. Deze snelle controle kan inzicht geven in vroege gebeurtenissen in tumor ontwikkeling of leiden tot kortere experimentele procedures.

Tumor celdood en necrose ten gevolge van hypoxie of medicamenteuze behandeling in een vroeg stadium aangegeven door een vermindering van de lichtgevende signaal. Deze cel dood zou niet gepaard gaan met een vermindering van de omvang van de tumor zoals gemeten door fysieke middelen. De mogelijkheid om vroeg gebeurtenissen te zien in tumor necrose heeft grote invloed op de selectie en ontwikkeling van therapeutische middelen.

Kwantitatieve beeldvorming van de groei van tumoren met behulp van IVIS zorgt voor een nauwkeurige kwantificering en versnelt het experimentele proces voor het genereren van resultaten.

Protocol

Een grote verscheidenheid van luciferase expressie kanker cellijnen kan gebruikt worden voor pre-klinisch onderzoek in muismodellen.

Deze cellen zijn bedoeld als een pathogeen-vrij bevroren cultuur, die gemakkelijk zal in standaard media groeien zonder de noodzaak voor selectie markers.

Voor ons experiment, zullen we gebruik maken van de 4T1-luc2 muriene mammatumor cellijn, die het luciferase-gen dat dient als een optische indicator van genexpressie of tumorgenesis in vivo uitdrukt. Wij zullen luciferase expressie om de groei van de primaire tumor niet-invasief track, maar ze kunnen ook worden gebruikt om te lokaliseren en monitoren metastatische laesies.

Luciferase-activiteit moet worden geverifieerd voor de injectie, en om dit te doen, is een 90% confluent fles geoogst door trypsinebehandeling en vervolgens geteld.

50.000 cellen worden vervolgens afgeleverd in een putje van een microtiterplaat en seriële verdunningen worden uitgevoerd. Luciferine wordt toegevoegd aan het putten op 150ug per ml en geïncubeerd gedurende 2 minuten. De microplaat kan worden afgebeeld in IVIS of een lichtgevende plaat lezer tot expressie te bepalen. Deze cellijn drukt tot 6500 fotonen per seconde per cel, maar elke expressie niveau boven de 500 fotonen per seconde per cel met succes kunnen worden afgebeeld in vivo.

Nu we cellen van optimale activiteit hebben, kunnen we overgaan tot de subcutane injectie stap.

Met het oog op een optimale detectie van de tumor te vergemakkelijken, maken we gebruik van een athymische immuungecompromitteerde naakt muizenstam. Voorafgaand aan de injectie, de dieren zijn verdoofd te zijn voor diepe anesthesie.

Vervolgens zullen injecteren tot 250.000 cellen in 100ul PBS worden subcutaan geïnjecteerd in de flank. Laad de cellen in een 1 ml injectiespuit en bevestig een 26 gauge naald. Til de huid met een tang om een ​​"tent" te maken en injecteren van de cellen aan de basis. De nieuw geïnjecteerde cellen kunnen direct worden afgebeeld. In elke opnamesessie een totaal van 150 mg van Luciferine per kg lichaamsgewicht wordt dan toegediend via twee injecties in de buikholte.

In dit onderzoek worden dieren afgebeeld 10 minuten na de injectie Luciferine om een ​​consistente foton flux te garanderen. We laten u deze in de volgende stap. Luciferine kinetiek kan variëren van dag tot dag. In dit specifieke model, afmeting van 10 minuten na de injectie Luciferine gaf een resultaat binnen een bereik van 15% variabiliteit.

Voor ons experiment zullen we gebruik maken van de IVIS Spectrum in vivo imaging systeem maakt gebruik van een back-uitgedunde Charge Coupled Device afgekoeld tot -90 ° C tot maximale gevoeligheid te bereiken. Ter ondersteuning van absolute kwantificatie, het systeem meet donkere lading tijdens het down-time en draait een zelf-calibratie tijdens de initialisatie. Om te beginnen imaging, initialiseren van de IVIS-systeem (een klik) en zet de imaging parameters voor het experiment.

Selecteer gezichtsveld voor het aantal dieren dat wordt afgebeeld. Tot 5 dieren kunnen worden gehandhaafd in het instrument met behulp van de geïntegreerde verdoving spruitstuk. Het podium is op een constante 37 ° C tot lichaamstemperatuur te handhaven in de dieren. Een ECG-poort is voorzien om de gezondheid van dieren te controleren tijdens stressvolle procedures.

In Living Image software, belichtingstijd, f-stop en pixel binning kunnen worden geoptimaliseerd op basis van het expressieniveau van de cellijn. Deze instellingen kunnen worden gewijzigd op elk moment tijdens een experiment zonder impact op de kwantitatieve resultaat.

IVIS verwerft een fotografisch beeld van het dier onder wit licht en een kwantitatieve bioluminescente of fluorescerende signaal, dat wordt overlay op het beeld.

De bioluminescente signaal wordt uitgedrukt in fotonen per seconde en wordt weergegeven als een intensiteit kaart. De afbeelding wordt aangepast aan een optimaal contrast en resolutie in het beeld te bieden zonder de kwantificatie.

Luminescentie van de cellen kan worden gemeten op de plaats van injectie met een regio van belang tool. Meetgegevens worden weergegeven in de tabel, samen met alle experimentele parameters met betrekking tot de foto te maken die kunnen worden opgeslagen of geëxporteerd voor analyse

Meerdere beelden kunnen worden verworven en vergeleken in longitudinale studies met betrekking tot seconde of maanden, afhankelijk van de aard van het experiment. Wij meten foton flux van de tumor op tijdstip nul en monitor voor 4 weken met een beeldvorming bij bi-wekelijkse intervallen.

Foton flux van de tumor is evenredig aan het aantal levende cellen die luciferase zo bioluminescentie correleert direct met omvang van de tumor.

Op 5 dagen na implantatie van de tumor is nog niet voelbaar, maar de cellen kunnen worden gekwantificeerd door middel van bioluminescentie en de tumor wordt gezien als actief groeiende. In dit stadium van de bioluminescentie signaal is veel Stronger. De belichtingstijd, f-stop en pixel binning kan worden aangepast zodat het beeld duidelijk is en de camera doet verzadigen niet. IVIS compenseert automatisch voor de veranderingen in het licht collectie, zodat deze metingen kunnen worden vergeleken met die vroeger en later verzameld in het experiment.

Op 7 dagen na implantatie tumoren worden voelbaar voor de eerste keer en bioluminescentie metingen al tot zeven dagen van gegevens.

Op de 28e dag na de implantatie, zijn tumoren worden necrotische en cellen beginnen te sterven. Tumorgrootte geschat door remklauw meting niet merkbaar veranderen, maar luminescentie van de tumor zal afnemen aangeeft celdood.

Remklauw metingen en bioluminescentie meting kan worden voortgezet tot een humane eindpunt is bereikt. Tumor necrose ten gevolge van hypoxie of behandelingen wordt aangegeven door een verminderde bioluminescentie, zelfs als zij niet de tumormassa te reduceren.