Summary
Cellules mammaires tumorales exprimant la luciférase sont implantés sous la peau chez la souris et visualisées à l'aide d'imagerie optique pour surveiller la croissance des tumeurs et le développement de façon non invasive dans une étude longitudinale.
Abstract
4T1 cellules tumeur mammaire de souris peut être implantée sous-cutanée dans la souris nu / nu pour former des tumeurs palpables dans 15 à 20 jours. Ce système de tumeur xénogreffe modèle est précieux pour le pré-cliniques dans l'évaluation in vivo de composés antitumoraux putatifs.
La lignée cellulaire 4T1 a été conçu pour exprimer le gène constitutivement la luciférase de luciole (luc2). Lorsque des souris porteuses de tumeurs 4T1-luc2 sont injectés avec luciférine les tumeurs émettent un signal de lumière visible qui peut être surveillé à l'aide d'un système d'imagerie optique sensible comme le spectre IVIS. Le flux de photons provenant de la tumeur est proportionnelle au nombre de cellules émettrices de lumière et le signal peut être mesuré pour contrôler la croissance tumorale et le développement. IVIS est calibré pour permettre la quantification absolue du signal de bioluminescence et les études longitudinales peuvent être réalisées sur plusieurs mois et sur plusieurs ordres de grandeur du signal sans compromettre le résultat quantitatif.
La croissance tumorale peut être surveillé pendant plusieurs jours par bioluminescence avant la taille de la tumeur devient palpable ou mesurables par des moyens physiques traditionnels. Ce contrôle rapide peut donner un aperçu des événements précoces dans le développement tumoral ou conduire à des procédures plus courtes expérimental.
Mort des cellules tumorales et la nécrose due à l'hypoxie ou le traitement médicament est indiqué au début par une réduction dans le signal de bioluminescence. Cette mort cellulaire pourrait ne pas être accompagnée d'une réduction de la taille tumorale telle que mesurée par des moyens physiques. La capacité de voir les événements précoces de nécrose tumorale a un impact significatif sur la sélection et le développement d'agents thérapeutiques.
Imagerie quantitative de la croissance tumorale en utilisant IVIS fournit quantification précise et accélère le processus expérimental pour produire des résultats.
Protocol
Une grande variété de luciférase exprimant des lignées cellulaires cancéreuses peuvent être utilisés pour la recherche pré-clinique dans des modèles murins.
Ces cellules sont fournies en tant que culture exempts d'agents pathogènes congelés, qui volontiers se développer dans les médias standards sans besoin de marqueurs de sélection.
Pour notre expérimentation, nous allons utiliser le 4T1-luc2 lignée murine de cellules tumorales mammaires, qui exprime le gène de la luciférase qui sert comme un indicateur optique de l'expression des gènes ou de tumorigenèse in vivo. Nous allons utiliser l'expression de luciférase pour suivre la croissance de la tumeur primaire non invasive, mais ils peuvent aussi être utilisées pour localiser et surveiller les lésions métastatiques.
L'activité luciférase doit être vérifiée avant l'injection, et pour ce faire, une fiole de 90% de confluence est récoltée par trypsinisation puis comptés.
50.000 cellules sont ensuite distribués dans un seul puits d'une plaque de microtitration et dilutions sont effectuées. Luciférine est ajoutée aux puits à 150ug par ml et incubé pendant 2 minutes. La microplaque peuvent être visualisées dans IVIS ou un lecteur de plaque luminescente afin de déterminer les niveaux d'expression. Cette lignée cellulaire exprime jusqu'à 6500 photons par seconde par cellule, mais aucun niveau d'expression de plus de 500 photons par seconde par cellule peut être imagée avec succès in vivo.
Maintenant que nous avons des cellules de l'activité optimale, nous pouvons passer à l'étape d'injection sous-cutanée.
Afin de faciliter la détection optimale de la tumeur, nous utilisons une souche athymiques immunodéprimés souris nude. Avant l'injection, les animaux sont anesthésiés à l'effet d'une anesthésie profonde.
Ensuite, nous allons injecter jusqu'à 250 000 cellules dans 100 ul de PBS sont injectés par voie sous cutanée dans le flanc. Chargez les cellules dans une seringue de 1 ml et fixer une aiguille de calibre 26. Soulevez délicatement la peau avec une pince pour faire une "tente" et d'injecter les cellules à la base. Les cellules nouvellement injectés peuvent être visualisés immédiatement. À chaque séance d'imagerie un total de 150mg de luciférine par kg de poids corporel est alors administrée par deux injections dans la cavité péritonéale.
Dans cette étude, les animaux sont imagés 10 minutes après l'injection de luciférine pour assurer le flux de photons cohérents. Nous allons vous montrer ce à l'étape suivante. Cinétiques luciférine peut varier de jour en jour. Dans ce modèle particulier, mesurant 10 minutes après l'injection luciférine a donné un résultat dans une fourchette de variabilité de 15%.
Pour notre expérience, nous allons utiliser le spectre IVIS l'imagerie in vivo système utilise un arrière-aminci charge coupled device refroidi à -90 ° C pour obtenir une sensibilité maximale. Pour soutenir la quantification absolue, le système des mesures de charge obscurité pendant les temps d'arrêt et exécute une auto-étalonnage lors de l'initialisation. Pour commencer l'imagerie, initialiser le système IVIS (un clic) et définissez les paramètres d'imagerie pour l'expérience.
Sélectionnez le champ de vision pour le nombre d'animaux étant imagé. Jusqu'à 5 animaux peuvent être maintenus dans l'instrument en utilisant le collecteur intégrante anesthésique. La scène est à 37 ° C à constamment maintenir la température corporelle chez les animaux. Un port ECG est fourni pour surveiller la santé des animaux pendant les procédures stressant.
Dans Vivre logiciel Image, temps d'exposition, f-stop et pixel binning peut être optimisée en fonction du niveau d'expression de la lignée cellulaire. Ces paramètres peuvent être modifiés à tout moment lors d'une expérience sans impact sur le résultat quantitatif.
IVIS acquiert une image photographique de l'animal sous une lumière blanche et un signal quantitatif bioluminescent ou fluorescent, qui est superposée sur l'image.
Le signal de bioluminescence est exprimé en photons par seconde et affichée comme une carte d'intensité. L'affichage de l'image est ajustée pour fournir un contraste optimal et la résolution de l'image sans affecter la quantification.
Luminescence des cellules peut être mesurée à l'endroit de l'injection en utilisant une région de l'outil d'intérêt. Les données de mesure sont affichées dans le tableau avec tous les paramètres expérimentaux relatifs à la capture d'images qui peuvent être enregistrés ou exportés pour une analyse
Plusieurs images peuvent être acquises et comparées dans les études longitudinales couvrant secondes ou quelques mois selon la nature de l'expérience. Nous allons mesurer le flux de photons provenant de la tumeur au temps zéro et moniteur pour 4 semaines avec l'imagerie au bi-hebdomadaire d'intervalle.
Flux de photons provenant de la tumeur est proportionnelle au nombre de cellules vivantes exprimant la luciférase pour la bioluminescence est directement corrélée avec la taille des tumeurs.
A 5 jours après l'implantation de la tumeur n'est pas encore palpables, mais les cellules peuvent être quantifiés par bioluminescence et la tumeur est considérée être en croissance active. A ce stade, le signal de bioluminescence est beaucoup StrongeR. Le temps d'exposition, f-stop et de pixel binning peut être ajustée de sorte que l'image est claire et la caméra ne sature pas. IVIS compense automatiquement les changements dans la collecte de lumière de sorte que ces mesures peuvent être comparées à celles recueillies précédemment et, plus tard dans l'expérience.
À 7 jours après l'implantation des tumeurs sont palpables pour la première fois et la bioluminescence de mesure a déjà généré de 7 jours de données.
A 28 jours après l'implantation, les tumeurs deviennent nécrotiques et les cellules commencent à mourir. La taille des tumeurs estimée par la mesure étrier ne change pas sensiblement, mais la luminescence de la tumeur diminue indiquant la mort cellulaire.
Mesures étrier et la mesure de la bioluminescence peut être poursuivi jusqu'à ce qu'un critère d'évaluation humanitaire est atteint. Nécrose tumorale due à l'hypoxie des régimes ou des traitements sera indiqué par bioluminescence réduite, même si elles ne réduisent pas la masse tumorale.
Disclosures
Je tiens à assurer que toutes les expériences effectuées pour produire le Journal de l'article Expériences visualisé ont été effectuées en conformité avec le Protocole de 060 animaux approuvé par le soin des animaux et des institutionnels Utilisez Comité (IACUC) à Caliper Life Sciences, Alameda CA Jae Kim, Ph . D., président IACUC, Caliper Life Sciences.
