IVIS 스펙트럼을 사용하여 내유 종양의 생체내 이미징에서 발광 생물

Summary

루시페라제 표현 내유 종양 세포는 생쥐의 subcutaneously 이식 및 비 invasively 종단 연구에 종양이 성장과 발전을 모니터 광학 이미징을 사용하여 시각입니다.

Abstract

4T1 마우스 내유 종양 세포는 15~20일에 만져서 알 수있는 종양을 형성 뉴 / 뉴 생쥐의 하위 cutaneously 이식 수 있습니다. 이 이종 이식 종양 모델 시스템 putative antitumor 화합물의 생체내 평가 미리 임상을 위해 중요합니다.

4T1 세포 라인은 constitutively 반딧불 루시페라제 유전자 (luc2)을 표현하기 위해 설계되었습니다. 4T1 - luc2 종양을 나르는 생쥐는 종양 IVIS 스펙트럼 같은 민감한 광학 이미징 시스템을 사용하여 모니터링할 수있는 영상 조명 신호를 방출 Luciferin로 주입하는 경우. 종양에서 광자 플럭스은 발광 세포의 개수에 비례하여 신호가 종양 성장과 발전을 모니터 측정할 수 있습니다. IVIS는 발광 생물 신호 및 종단 연구의 절대 quantitation이 양적 결과를 손상시키지 않고 몇 개월 동안 신호 크기의 여러 명령을 통해 수행할 수 있도록 조정합니다.

종양 크기가 기존의 물리적인 방법으로 만져서 알 수있는 또는 측정되기 전에 종양 성장 bioluminescence으로 며칠 동안 모니터링할 수 있습니다. 이것은 급속한 모니터링 종양 발달 초기에 이벤트에 대한 통찰력을 제공하거나 짧은 실험 절차를 초래할 수 있습니다.

종양 세포 죽음과 hypoxia 또는 약물 치료에 의한 괴사는 발광 생물 신호의 감소에 의해 초기 표시됩니다. 이 세포 죽음을 물리적인 방법으로 측정으로 종양의 크기 감소에 의해 동반되지 않을 수도 있습니다. 종양 괴사의 초기 이벤트를 볼 수있는 능력은 치료 요원의 선택과 개발에 상당한 영향을 미치고 있습니다.

IVIS를 사용하여 종양 성장의 양적 영상은 정확한 quantitation를 제공하고 결과를 생성하기 위해 실험 과정을 가속.

Protocol

루시페라제 표현 암 세포 라인의 다양한는 마우스 모델에서 미리 임상 연구에 사용될 수 있습니다.

이러한 세포는 쉽게 선택 마커에 대한 필요가 표준 미디어 성장하는 병원체가없는 냉동 문화로 제공됩니다.

우리의 실험을 위해, 우리는 생체내의 유전자 발현이나 tumorgenesis의 광학 지표 역할을 루시페라제 유전자를 표현 4T1 - luc2 murine 내유 종양 세포 라인을 사용합니다. 우리는 비 invasively 기본 종양의 성장을 추적하는 루시페라제 표현을 사용하지만, 그들은 또한 전이성 병변을 찾아 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다.

루시페라제 활동 주입하기 전에, 그리고이 작업을 수행하기 위해서는 검증해야 90% 합류 플라스크는 trypsinization에 의해 수확 후 계산됩니다.

수행하는 50,000 셀이 다음 microtiter 접시 및 시리얼 dilutions의 단일 우물에 적절하고 있습니다. Luciferin는 ML 당 150ug에있는 우물에 추가 2 분 동안 incubated입니다. microplate는 IVIS이나 표현 수준을 결정하는 발광 판 Reader에서 몇 군데 있습니다. 이 세포 라인은 초당 세포 당 6,500 광자까지 표현하고 있지만, 초당 셀 당 500 광자 이상 어떤 표현 수준은 생체내에서 성공적으로 몇 군데 있습니다.

이제 우리는 최적의 활동의 세포를 가지고, 우리는 피하 주입 단계로 진행할 수 있습니다.

종양의 최적의 검출을 용이하게하기 위해, 우리는 athymic immunocompromised 누드 마우스 변형을 사용하고 있습니다. 주사하기 전에, 동물 깊은 마취에 대한 효과 anesthetized 있습니다.

다음 우리가 100ul PBS에서 250,000 세포까지 주사할 수는 측면으로 subcutaneously 주입하고 있습니다. 1 ML의 주사기에있는 세포를로드하고 26 게이지 바늘을 첨부합니다. 포셉는 "텐트"하고 기지에 세포를 주입 함께 부드럽게 피부를 들어 봐요. 새로 주입된 세포는 즉시 몇 군데 있습니다. 각 이미지 세션에서 kg의 체중 당 Luciferin의 150mg의 총 후 복막 구멍 두개의 주사를 통해 관리합니다.

본 연구에서는 동물은 일관성있는 광자 유량을 보장하기 위해 Luciferin 주입 후 10 분 몇 군데 있습니다. 우리는 다음 단계에서 당신에게 보여 드리죠. Luciferin 동력학은 매일 다를 수 있습니다. 이 특정 모델에서 Luciferin 주입 후 10 분 측정하면 15 %의 다양성의 범위 내에서 결과를 주었다.

우리 실험에서는 우리는 다시 - thinned 요금 결합 소자 ° C 최대 감도를 달성하기 위해 -90으로 냉각을 사용하여 생체내 이미징 시스템에서 IVIS 스펙트럼을 사용합니다. 절대 quantitation를 지원하기 위해, 시스템 다운 시간 동안 어두운 요금을 측정하고 초기화하는 동안 자체 보정을 실행합니다. 이미징을 시작하려면, IVIS 시스템을 초기화 (한 번의 클릭) 및 실험을위한 이미징 매개 변수를 설정합니다.

몇 군데되는 동물의 숫자에 대한보기의 필드를 선택합니다. 최대 5 동물은 필수 마취 매니폴드를 사용하여 장비 유지하실 수 있습니다. 무대는 상수입니다 37 ° C 동물​​의 체온을 유지하기 위해. EKG 포트가 스트레스 절차 기간 동안 동물의 건강을 모니터링하기 위해 제공됩니다.

이미지 소프트웨어, 노출 시간, F - 중지하고 픽셀을 생활 비닝은 세포주의 표현 수준에 따라 최적화할 수 있습니다. 이러한 설정은 양적 결과에 영향을주지 않고 실험 도중 언제든지 변경할 수 있습니다.

IVIS 흰 빛과 이미지를 중첩되는 정량 발광 생물이나 형광 신호, 아래에있는 동물의 사진 이미지를 얻습니다.

발광 생물 신호는 초당 광자로 표현하고 강도지도로 표시됩니다. 이미지 디스플레이는 quantitation에 영향을주지 않고 이미지에 최적의 콘트라스트와 해상도를 제공하기 위해 조정됩니다.

세포에서 발광이 관심을 도구의 영역을 사용하여 주사의 사이트에서 측정할 수 있습니다. 측정 데이터는 저장하거나 분석을 위해 내보낼 수있는 이미지 캡처에 관한 모든 실험 매개 변수와 함께 테이블에 표시됩니다

여러 이미지를 획득하여 실험의 특성에 따라 초 개월에 걸쳐 종단 연구에 비교할 수 있습니다. 우리는 시간 제로에서 종양에서 광자 자속을 측정하고 격주 간격으로 이미지와 함께 4 주 동안 모니터합니다.

종양에서 광자 유량은 bioluminescence는 종양의 크기와 직접 연결합니다 그래서 루시페라제을 표현하는 라이브 세포의 수에 비례합니다.

오일 포스트 주입에 종양이 아직 만져서 알 수있는 것이 아니라 세포가 bioluminescence과 종양이 적극적으로 성장을 보아입니다 통해 계량하실 수 있습니다. 이 단계에서는 bioluminescence 신호는 훨씬 stronge입니다R. 노출 시간, F - 중지하고 픽셀 비닝는 이미지가 명확하고 카메라가 포화되지 않도록 조정할 수 있습니다. 이러한 측정은 실험에 이전 이후 수집들에게 비교할 수 있도록 IVIS 자동으로 집광의 변화에​​ 대한 보상.

칠일에 게시 주입 종양 측정은 이미 데이터가 7 일 발생한 것은 이번이 처음과 bioluminescence에 대한 만져서 알 수있는 수 있습니다.

28일 포스트 주입에서 종양 괴사되고 있으며, 세포는 죽지 시작합니다. 캘리퍼스 측정하여 예상 종양 크기는 appreciably 변경되지 않습니다하지만, 종양의 발광은 세포 죽음을 나타내는 줄어 듭니다.

인도적 종점에 도달할 때까지 캘리퍼스 측정 및 bioluminescence 측정 계속하실 수 있습니다. hypoxia 또는 치료 정권에 의한 종양 괴사들은 종양 질량을 감소하지 않더라도 감소 bioluminescence로 표시됩니다.