Summary
In diesem Video zeigen wir eine Methode, mit der sich entwickelnden Gehirn Wirbeltiere in Live Zebrafischembryonen bei einzelnen Zelle Auflösung durch konfokale Mikroskopie zu analysieren. Dazu gehört auch die Methode, mit der wir spritzen die Single-Cell-Zebrafischembryo und anschließend montieren und Bild das sich entwickelnde Gehirn.
Abstract
In diesem Video zeigen wir die Methode unserem Labor entwickelt, um die Zellform Änderungen und Umstellungen erforderlich zu biegen und falten Sie die Entwicklung von Zebrafisch Gehirn (Gutzman et al, 2008) analysiert hat. Eine solche Analyse bietet ein neues Verständnis der zugrunde liegenden Zellbiologie für die Entwicklung der 3D-Struktur von Gehirn der Wirbeltiere erforderlich und erhöht unsere Fähigkeit, Neuralrohr Morphogenese zu studieren. Die embryonalen Zebrafisch Gehirn ist so geformt, Beginn 18 Stunden nach der Befruchtung (HPF) als die Ventrikel im Neuroepithel aufzublasen. Bis zum 24. hpf, sind die ersten Schritte von Neuralrohrdefekten Morphogenese abgeschlossen. Mit der hier beschriebenen Methode, werden Embryonen auf der einen Zell-Stadium mit mRNA Membran gezielte grün fluoreszierende Protein (memGFP) injiziert. Nach der Injektion und Inkubation des Embryos, die jetzt zwischen 18 und 24 HPF, montiert ist, invertiert, in Agarose und abgebildet durch konfokale Mikroskopie. Bemerkenswert ist, dass der Zebrafisch-Embryos transparent machen ihn zu einem idealen System für Fluoreszenz-Bildgebung. Während unsere Analysen auf das Mittelhirn-Hinterhirn-Grenze und die Hinterhirn konzentriert haben, könnte diese Methode für die Analyse von jeder beliebigen Region der Zebrafisch zu einer Tiefe von 80-100 mu m verlängert werden.
Protocol
1. Vorbereitung der mRNA für die Injektion
- Die mRNA in diesem Verfahren verwendet wird, aus einem Plasmid kodiert CAAX-eGFP (memGFP) mRNA transkribiert. Erste Linearisierung des Plasmids nach Gutzman et al, 2008.
- Dann transkribieren memGFP mRNA mit der mMessage mMachine Kit.
- Verdünnen Sie die resultierende mRNA zu 1μg/μl aliquotieren und bei -80 ° C.
- Bereiten Sie ein Spritzgießwerkzeug von 1% Agarose mit Gassen der Breite des Embryos auf der einen Zell-Stadium.
- Am Tag vor der Injektion, Einrichten Paarung Käfige trennen das Männchen vom Weibchen.
- Am Tag der Injektion, ziehen Kapillare Nadeln mit einer Mikropipette Abzieher, um die Injektion vorzubereiten.
2. Injektion der mRNA
- Am Tag der Injektion, Tauwetter ein Aliquot 1μg/μl memGFP mRNA auf Eis.
- Verdünnen Sie die mRNA 1:5 in Wasser zu einer Endkonzentration von 200ng/μl, und halten Sie auf dem Eis.
- Laden Sie die Kapillarnadel mit 1μl präparierte memGFP mRNA bei 200ng/μl.
- Ort geladen Nadel in einem Mikromanipulator an einem gasbetriebenen Mikroinjektor.
- Passen Sie das Injektionsvolumen zu 1NL.
- Ziehen Sie die Trennwände auf Wildtyp-Fisch in Käfige Paarung vom Vortag eingestellt.
- Sammeln Sie die Embryonen, sobald sie festgelegt sind. Orient ihnen in der Agarose Spritzgießwerkzeug durch Embryo Medium (Westerfield, 1995) mit dem einzigen Zelle auf der abgewandten Seite der Mikromanipulator abgedeckt.
- Inject durch das Chorion und Dotter, so dass die mRNA direkt in die einzelne Zelle abgelagert. Inject ca. 50 Embryonen pro Versuch. Spritzen Sie sich nicht, wenn die Zelle geteilt.
- Inkubieren Embryonen bei 28 ° C über Nacht in Embryo-Medium
3. Montage-und Imaging Embryos
- Zur Montage und Bild die Embryonen, entfernen Sie das Chorion mit einer Pinzette aus der Embryonen unter dem Stereomikroskop 1 Stunde vor der Zeit in der Umgebung.
- Bereiten Sie eine Rutsche für die Montage von bis zu 4 Embryonen.
- Verwenden Sie Silikon-Vakuum-Fett auf einem Deckglas auf der Unterseite ein speziell entwickeltes 2mm dicke Kunststoff-Folie mit einem Loch ca. 1 cm im Durchmesser zu versiegeln.
- Füllen Sie das Loch in der Folie mit 0,7% Agarose, und lassen Sie stehen etwa 20 Minuten oder bis gehärteten
- Nachdem die Agarose erstarrt ist, entfernen Sie einen kleinen Stecker mit 200 ul Pipettenspitzen zylindrische Löcher bilden, in dem jeder Embryo montieren zu.
- Legen Sie die Embryonen auf die Agarose gefüllten Objektträger unter einem Binokular. Add 50 ul Tricaine (Westerfield, 1995), die Embryonen zu betäuben.
- Verwenden einer Pinzette, um die Embryonen in die zylindrische Löcher in die Agarose mit dem Gehirn oder der Region von Interesse gegen die zugrunde liegende Deckglas Position.
- Decken Sie die Embryonen in die Agarose mit einem anderen Deckglas mit Silikon Vakuumfett gesichert.
- Bild des Embryos mit einem umgekehrten, Neonlicht, Laser-Scanning-oder Spinning-Disk-konfokalen Mikroskop. Bild bei 63x oder höher, um Bilder mit hoher Auflösung einzelner Zellen innerhalb der Neuroepithel sammeln.
- Die Bilder werden als TIFF-Dateien aus dem LSM-Software exportiert und analysiert mit Hilfe von Photoshop.
4. Repräsentative Ergebnisse / Outcome
In Abbildung 1 ist eine repräsentative konfokale Abbildung eines 24 hpf Zebrafisch Neuroepithel zwischen dem Mittelhirn und Rautenhirn Ventrikel. Jede Zelle ist mit Membran-gebundenen GFP-markierten.
Abbildung 1. Live-konfokale Abbildung eines memGFP injiziert 24 hpf Zebrafischembryo.
(A) Neuroepithel eines 24 hpf Embryo mit jeder Zelle durch GFP skizziert. Region abgebildet trennt das Mittelhirn und Hinterhirn Ventrikel (M, H bzw.), bildet das Mittelhirn-Hinterhirn-Grenze.
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Discussion
In diesem Video zeigen wir eine Methode zur mRNA-Injektion in einzelne Zelle Zebrabärblinge. Hier verwenden wir mRNA eine Membran gezielte GFP zu jeder Zelle Label. Wir haben dann gezeigt, wie die Montage und Bild das sich entwickelnde Gehirn in einzelnen Zelle Auflösung. Diese Technik hat uns erlaubt, eine neue Art von Zelle Form zu ändern, basale Einschnürung, für die Bildung der Mittelhirn-Hinterhirn-Grenze (Gutzman et al, 2008) erforderlich studieren. Ähnliche Analyse von anderen Phänomenen hat das Potenzial, deutlich erweitern unser Verständnis von Wirbeltieren Morphogenese und die zugrunde liegenden Zellbiologie.
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Acknowledgments
Vielen Dank an Dr. Jennifer Gutzman, die als erste entwickelt diese Technik in der Sive Labor. Danke auch an JB Green am Dana-Farber Cancer Institute Boston, MA, die uns freundlicherweise zur Verfügung gestellt das Plasmid kodiert CAAX-GFP mRNA. Die konfokale Bildgebung wurde an der WM Keck Foundation Biological Imaging Facility am Whitehead durchgeführt. HS wird durch NIHMH70926 unterstützt. EG wird durch einen NSF pre-Stipendium unterstützt.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| SeaKem GTG agarose | Reagent | Lonza Inc. | 50027 | |
| 3-aminobenzoic acid ethyl ester (Tricaine) | Reagent | Sigma-Aldrich | A-5040 | |
| Capillary tubing | Tool | Frederick Haer and Co. | 30-30-1 | Borosil 1.0mmOD x 0.5mm ID/fiber 100mm |
| Silicone vacuum grease | Reagent | VWR international | W0S717 | |
| Forceps | Tool | Fine Science Tools | 11232-20 | Dumont #5 Bio Inox |
| 1-200 μl Pipette tips | Tool | USA Scientific, Inc. | 111-0806 | These are the correct size for 24 hpf embryos. |
| mMessage mMachine transcription kit | Reagent | Ambion | AM1340 | SP6 RNA polymerase |
| Zeiss LSM 510 scanning confocal | Microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Micromanipulator | Tool | Narishige International | ||
| Microinjector | Tool | Harvard Apparatus | PLI-100 | |
| Micropipette puller | Tool | Sutter Instrument Co. |
References
- Gutzman, J. H., Graeden, E., Sive, H. Formation of the zebrafish midbrain-hindbrain boundary constriction requires laminin-dependent basal constriction. Mech Dev. 125 (974), 11-12 (2008).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: a Guide for the Laboratory Use of Zebrafish. , University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (1995).
