חיים הדמיה של המוח על ידי עוברי דג הזברה מיקרוסקופיה confocal

Summary

בסרטון הזה, אנחנו מראים שיטה שבאמצעותה לנתח את המוח חוליות עוברי דג הזברה מתפתח לחיות ברזולוציה של תא בודד על ידי מיקרוסקופיה confocal. זה כולל את השיטה שבאמצעותה אנו מזריקים את העובר מתא בודד דג הזברה ולאחר מכן הר התמונה במוח המתפתח.

Abstract

בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את השיטה במעבדה שלנו פיתחה לנתח את צורת התא שינויים rearrangements נדרש לכופף ולקפל את המוח דג הזברה מתפתח (Gutzman et al, 2008). ניתוח כזה מאפשר הבנה חדשה של ביולוגיה של התא הבסיסי הדרוש לפיתוח של מבנה 3D של המוח החוליות, מגביר באופן משמעותי את היכולת שלנו ללמוד המורפוגנזה בצינור העצבי. המוח העוברי היא בצורת דג הזברה החל הפריה 18 שעות שלאחר (hpf) כמו החדרים בתוך neuroepithelium לנפח. עד hpf 24, השלבים הראשונים של המורפוגנזה בצינור העצבי הושלמו. באמצעות השיטה המתוארת כאן, עוברים בשלב מסוים התא מוזרקים עם קידוד mRNA קרום במיקוד חלבון פלואורסצנטי ירוק (memGFP). לאחר hpf הזרקת הדגירה, העובר, בין 18 ל 24 עכשיו, הוא רכוב, הפוך, ב agarose הדמיה על ידי מיקרוסקופיה confocal. יש לציין כי העובר דג הזברה שקוף שהופך אותו אידיאלי עבור מערכת דימות פלואורסצנטי. בעוד ניתוחים שלנו התמקדו גבול למוח האחורי, המוח התיכון לבין למוח האחורי, שיטה זו ניתן יהיה להרחיב לניתוח האזור כל דג הזברה עד לעומק של 8-10 מיקרומטר.

Protocol

1. הכנת ה-mRNA עבור הזרקה

1. MRNA השתמשו בהליך זה הוא עיבד מ קידוד פלסמיד CAAX-eGFP (memGFP) mRNA. ראשית linearize פלסמיד לפי Gutzman et al, 2008.
2. ואז לתמלל mRNA memGFP באמצעות mMachine mMessage ערכת.
3. לדלל את ה-mRNA שנוצר 1μg/μl, aliquot, ולאחסן ב -80 ° C.
4. הכן עובש הזרקת agarose של 1% עם נתיבים ברוחב של עוברים בשלב אחד את התא.
5. יום לפני ההזרקה, להקים כלובי ההזדווגות הפרדת הזכר מן הנקבות.
6. ביום של הזריקה, למשוך מחטים נימי באמצעות חולץ micropipette להתכונן ההזרקה.

2. הזרקת ה-mRNA

1. ביום של הזריקה, להפשיר aliquot של mRNA memGFP 1μg/μl על הקרח.
2. לדלל את ה-mRNA 01:05 במים לריכוז סופי של 200ng/μl, ולשמור על הקרח.
3. טען את המחט נימי עם 1μl של mRNA memGFP מוכן ב 200ng/μl.
4. מקום טעון מחט לתוך micromanipulator מצורף בנזין microinjector.
5. התאם את עוצמת הזריקה כדי 1nl.
6. משוך את חוצצים על דגים סוג בר להגדיר בכלובים זיווג מן היום הקודם.
7. אסוף את העוברים ברגע שהם הניחו. אוריינט אותם עובש הזרקת agarose מכוסה על ידי בינוני העובר (Westerfield, 1995) עם תא בודד בצד הרחק micromanipulator.
8. הזרק דרך סיסית ו חלמון כזה mRNA מופקד ישירות לתא בודד. להזריק כ 50 עוברים לכל ניסוי. אין להזריק אם התא חילק.
9. עוברים דגירה על 28 ° C במשך הלילה בינוני העובר

3. הרכבה ועוברים הדמיה

1. כדי לטעון את התמונה עוברי, להסיר את סיסית עם מלקחיים מן העוברים תחת stereomicroscope שעה אחת לפני נקודת הזמן של עניין.
2. הכינו שקופית עבור הרכבה עד 4 עוברים.
   • השתמש ואקום גריז סיליקון לאטום coverslip על החלק התחתון של שקופית 2 מ"מ בעובי במיוחד פלסטיק עם חור בקוטר של כ 1cm.
   • ממלאים את החור שקופית עם agarose 0.7%, ולתת לעמוד כ -20 דקות או עד מוקשה
   • לאחר agarose יש הקרושה, להסיר תוסף קטן בעזרת פיפטה 200μl טיפים ליצירת חורים גליליים שבו לעלות כל העובר.
3. מניחים את העוברים בשקופית agarose המלא תחת מיקרוסקופ לנתח. הוסף 50μl של tricaine (Westerfield, 1995) כדי להרדים את העוברים.
4. שימוש במלקחיים לתפקיד עוברים את החורים גלילי ב agarose עם המוח או באזור של עניין נגד coverslip הבסיסית.
5. מכסים את העוברים על agarose עם coverslip נוסף מאובטח עם גריז סיליקון ואקום.
6. תמונה העובר באמצעות הפוכה, פלורסנט, לייזר או סריקת דיסק ספינינג מיקרוסקופ confocal. תמונה ב 63x או יותר לאסוף תמונות ברזולוציה גבוהה של תאים בודדים בתוך neuroepithelium.
7. תמונות מיוצאים כקובצי TIFF מתוך התוכנה LSM ונותחו באמצעות Photoshop.

4. תוצאות נציג / תוצאה

שמוצג באיור 1 היא תמונה confocal נציג neuroepithelium hpf 24 דג הזברה בין המוח התיכון, ואל החדרים למוח האחורי. כל תא מסומן עם GFP קרום הנכנס.

באיור 1. חיים הדמיה confocal של העובר memGFP-מוזרק hpf 24 דג הזברה.
(א) Neuroepithelium של עובר 24 hpf עם כל תא שהותוו על ידי ה-GFP. אזור צילמו מפריד בין המוח התיכון ואת החדרים למוח האחורי (ז, ח, בהתאמה), ויצרו את הגבול המוח התיכון, למוח האחורי.

Discussion

בסרטון הזה, אנחנו מראים שיטה הזרקת mRNA עוברי דג הזברה לתוך תא בודד. כאן, אנו משתמשים mRNA קידוד GFP קרום במיקוד לתייג כל תא. לאחר מכן, אנו מדגימים כיצד הר התמונה במוח המתפתח ברזולוציה של תא בודד. טכניקה זו אפשרה לנו ללמוד סוג חדש של שינוי צורת התא, ההתכווצות הבזליים, נדרש היווצרות גבול למוח האחורי, המוח התיכון (Gutzman et al, 2008). ניתוח דומה של תופעות אחרות יש פוטנציאל להרחיב באופן משמעותי את הבנתנו המורפוגנזה החולייתנים לבין ביולוגיה של התא הבסיסי.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
SeaKem GTG agarose	Reagent	Lonza Inc.	50027
3-aminobenzoic acid ethyl ester (Tricaine)	Reagent	Sigma-Aldrich	A-5040
Capillary tubing	Tool	Frederick Haer and Co.	30-30-1	Borosil 1.0mmOD x 0.5mm ID/fiber 100mm
Silicone vacuum grease	Reagent	VWR international	W0S717
Forceps	Tool	Fine Science Tools	11232-20	Dumont #5 Bio Inox
1-200 μl Pipette tips	Tool	USA Scientific, Inc.	111-0806	These are the correct size for 24 hpf embryos.
mMessage mMachine transcription kit	Reagent	Ambion	AM1340	SP6 RNA polymerase
Zeiss LSM 510 scanning confocal	Microscope	Carl Zeiss, Inc.
Micromanipulator	Tool	Narishige International
Microinjector	Tool	Harvard Apparatus	PLI-100
Micropipette puller	Tool	Sutter Instrument Co.