Summary
高分辨率CA的详细信息的方法
Abstract
的Ca 2 +平滑肌的成像提供进入细胞的机制，可能无法导致膜电位的变化，如从内部存储的Ca 2 +释放，的洞察力，并允许同时监控多个单元格，例如，评估，耦合合胞体组织。亚细胞的Ca 2 +瞬变共同平滑肌，但因为他们随机发生的看法往往是广泛的领域，造成的问题，器官，难以准确衡量，它容易产生合同。为了克服这个问题，我们已经开发了一系列的成像协议和分析程序的收购，然后分析，以自动方式，频率，此类事件的位置和幅度。虽然这种方法可应用在其他情况下，我们自己的工作，涉及当地嘌呤钙的检测，定位与亚微米分辨率的递质释放的瞬变。
从cotransmitter植物神经，它结合P2X1受体对逼尿肌和输精管的平滑肌ATP释放。 钙离子进入平滑肌，造成嘌呤neuroeffector的Ca 2 +瞬变（NCTS）。协调中心的Ca 2 +瞬变允许的方式，对电的诸多优势中的神经递质释放的光学监测。除了大大提高了空间分辨率，光学记录允许从许多同时分辨网站的记录递质释放的额外优势。此外，光学平面的重点是更容易保持正确或在长时间录音系列比细胞内的尖锐的微电极的重新定位。
总之，概述的Ca 2 +荧光成像的方法，详细介绍了组织准备，数据的采集和分析。我们概括了几个剧本， 如钙瞬变分析使用。
Protocol
第1部分：制备的Ca 2 +指示剂 （俄勒冈州绿488 BAPTA - 1上午）
- 俄勒冈州绿488 BAPTA - 1上午有少量粉（50微克）500μL小瓶。添加40μL聚醚F - 127解决方案的粉末，轻轻摇动30秒，然后加入460μLPSS的，并轻轻摇晃30秒最终的解决方案，10微米俄勒冈绿488 BAPTA - 1上午，提供了4 × 125μL分装。避免暴露于光线和储存在-20℃
第2部分： 钙离子加载
- 取出的Ca 2 +（-20℃）冷冻指标（俄勒冈州绿488 BAPTA - 1上午），并允许在室温下解冻。
- 取1毫升PSS在试管中，在水浴地方。与95％的O 2 / 5在泡沫出现每秒约1率2％的二氧化碳气泡。起泡需要将试管与塞或封口膜，例如担保。
- 从动物解剖组织，在Sylgard林立的培养皿中，小心地取出结缔组织。无论平滑肌器官类型，PSS的应更换一次10分钟和组织应清洗（例如，通过更换PSS三次）以下清扫。输精管：考虑器官切割长度的方法来生产的组织表。膀胱：膀胱颈（后）纵向打开圆顶的顶部（前）。准备4条，6 - 8毫米长和1 - 2毫米宽，沿背水面的逼尿肌，切割中的主导肌束方向。
- 解剖中的“预热和冒泡”的PSS的组织。
- 加入125μL10μmol俄勒冈绿488 BAPTA - AM试管，并给予一点点的动摇，用手混合。
- 继续冒泡离开，用铝箔纸覆盖。时间是需要足够的组织采取的Ca 2 +指示剂组织和平滑肌层厚度的大小而异。例如：70分钟“（小鼠逼尿肌，大鼠anococcygeus）为120分钟（大鼠逼尿肌，小鼠输精管）。
第3部分：准备显微镜“的Ca 2 +装”组织
仔细组织穿针，以尽量减少组织的自发运动（一个相对完整的组织的平滑肌细胞成像的财产）和一个合适的地点，以方便成像的位置（如平片的组织可能是必要的调查在两个层面，而不是三个，）。
- 冒泡PSS的组织冲洗至少5分钟。
- 安装在Sylgard列队准备菜，拉伸组织（略），形成一个平板。避免使用长的“管脚”可能划伤的目标;使用直径为25-50微米的银线，而不是短期的长度为“管脚”，并插入一个角度。
- 显微镜舞台上的位置准备的菜，要小心，以确保PSS的不逃避的菜Sylgard林立的区域（因为这可能会导致大面积覆盖在PSS灌流开始时）。
- 为了泵切换到superfuse PSS的准备。每小时100毫升的速度往往是就业。
- 暖风机上的开关。
- 广场上的准备菜（贴上磁铁底座上的每个钢带）的流入和流出管和温度探头。流出管尖的高度，将确定的PSS的深度。要小心，以确保流出实际上是消除PSS的（因为它有时并不最初）。
- 设置的暖风机上的温度达到所需的温度，如33-35 C.
- 允许组织以平衡至少10分钟。
第4部分：图像选址
曝光激发照明光漂白的指标，这样可以避免使用超过几秒钟的时间。
- 随着低功耗目标（10X或20X）使用蓝色光epifluorescence的，令人振奋，以查看平滑肌，并确定一个合适的区域监测。尽量挑一个网站的基础上：运动（这应该是最小的）和平滑肌细胞的数量在该领域。明亮的“结构”，可能会导致大量的“误报”图像检测算法，这样就可以避免（如）穿插上皮细胞或成纤维细胞中有大量的网站。
- 切换到一个更高的功率目标（40X）。
- 旋转舞台或光轴，使平滑肌细胞（S）位于水平（即快速扫描轴平行）。
第5部分：共聚焦显微镜
共聚焦显微镜的细节是“成立”是具体到每个显微镜类型，但关键因素是：速度（最低为5 Hz大部分的Ca 2 +瞬变的要求）;分辨率和大小的领域（这两项交易，与速度） 。以下协议的一些具体徕卡SP2直立共聚焦显微镜。一个典型的协议是：100架系列，在5 Hz（256 × 256像素;约100 x 100微米。）收购或13.5赫兹（256 x 64像素，约100 × 25微米。）。扫描头设置双向移动（最大限度地采集速度），并获得在每行的1000赫兹。
- 关闭针孔一个“通风磁盘”。
- 设置的AOTF的25至35％（488纳米）的激光功率，这个值是亮度和漂白之间的权衡。 （后者是在长时间录音的一个特别的问题。）
- 采集每个站点的六个系列，及四 - '待遇'，每六个网站。它的共同目标显示器相同的六个地点前的药物（即“控制”）和药后，虽然显着的漂白，可能会导致实验者偏离这个。
- 执行，“时间控制”，它是必不可少与 Ca 2 +成像的。
第6部分：分析的准备工作
- 下载并安装图像j从：http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html。下载特定于平台的版本，然后从http://rsb.info.nih.gov/ij/upgrade/ij.jar下载最新的imageJ.jar文件，替换旧的文件更新到最新版本。苹果Mac用户：如果它的运行速度很慢，确保您使用最新版本的Java虚拟机（JVM）可从苹果（http://www.apple.com/macosx/features/java/）。
- 下载Excel_writer.jar：http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/excel-writer.html和插件安装到[目录]> jar目录。
- 复制的Plugins目录中的下列文件：Leica_SP2_Stacker.class; JNCT0.08Release.ijm。这些脚本安装使用插件[菜单]>宏>安装... ImageJ功能。
- 我们使用可视作为一个单一的'电影'在软件生成的每一个系列的Leica SP2激光共聚焦显微镜，该软件（莱卡，LCS），但保存为单独的帧。要改造成系列的帧：（一）确保所有的“框架”，以重建在一个文件夹（如“DataFolder> TIFF格式”）。 （ii）选择插件[菜单]>宏> Leica_SP2_Stacker。选择根目录（例如，“DataFolder”）。从下拉列表（例如'TIFF格式/'）选择所需的文件夹。选择输出目录或生成一个新的（如“DataFolder>书库”）。然后，该脚本将重建一系列单个帧。
第7部分：运动更正
虽然运动的影像网站可能具有良好的钉最小化和均匀拉伸的组织，一些平滑肌机关表现出自发性收缩，不能小心寄托单独取消。在这里，我们描述了使用免费提供的算法，该算法在一系列的帧对齐或匹配。
- 下载“StackReg”（http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/）和“TurboReg”（http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/）。
- 安装到每个插件使用的插件目录>宏>安装...
- 加载要处理的堆栈（文件>打开... ...），然后转移到一个框架，清楚地显示感兴趣的领域。其他帧将对准这个参照系。
- 插件>书库> StackReg。尝试每个不同的“转变”（即翻译，刚体，缩放旋转，仿射），以确定哪些是最有效的的。 （进一步的细节：http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/）
第8部分：粒子探测算法
成像对于每一个“地盘”，这些因素会有所不同，影响的Ca 2 +瞬变检测。通过测量每个站点的某些属性（“粒子参数” - 详列如下），在检测过程中提供便利。因此，为每个站点，减去一个计算“门槛”，“阈值的比例”和“细胞边缘门槛”。
- 插件[菜单]>宏>安装，并选择“JNCT0.08Release.ijm”。
- 插件[菜单]>宏>装入堆栈（快捷键：L）。选择一个系列，并计算出粒子参数：
- A.阈值减去（背景）
- 您认为是什么“背景”，选择一个长方形的投资回报率。
- 测量（快捷键：M）。记下的意思。
- B.为比例计算的门槛
- 选择一个矩形细胞（S）的光学平面面积的投资回报率大约。
- 测量（快捷键：M）。注意上下的均值和标准差。
- 重复再两次或一次，可以得出按“转向”三盒。
- 计算并记下为比例阈值=（1 + SD /平均值）× 32，平均每三个值复制/网站。
- C.小区边缘的门槛
- 图像>书库> Z项目...选择投影类型：“平均强度”
- 图像>调整>阈值。
- 选择黑色和白色。
- 定义“下的”（上滑块）限制，并记下相应的值（滑块权）。只有在黑色区域发生的事件将被计算在内。
- 点击“重置”。
- 分析栈（快捷键：2）
- 在此阶段只选择一个系列，即“第一个文件”和“最后文件”应该是相同的。
- 输入值的“门槛减去”和“细胞边缘阈值”，“最低比例”。保留其他设置为默认值。
- 该算法会产生，其中加工系列是显示在左侧和右侧的原的双窗格窗口。经过仔细评估的事件，用肉眼可见，有没有被发现的误报和场合。为了得到更准确的检测钙瞬变可能需要稍微调整的“粒子参数” 。虽然过程可能会显得有点“碰运气”在第一次尝试，很快就会以什么参数是关键的感觉。
- 对于每一个系列，该算法产生一个Excel文件，检测到的事件的细节特征（如幅度，面积和位置）。 “误报” - 可能会被删除，由专人从这个Excel文件，审查的图像算法的输出文件（如步骤8.17） - 确定。
Discussion
荧光灯的Ca 2 +指示剂的选择
俄勒冈州的绿488 BAPTA凌晨1点被选择的Ca 2 +指示剂 ，因为它（我）是光明的，相比其他指标（如氟- 4和钙绿 ）1，（ii）是敏感的生理变化， 在Ca 2 +浓度一个类似规模的1细胞内的Ca 2 +浓度的[Ca 2 +] I（VAS如输精管2）K D;（三）加载许多平滑肌细胞，使平滑肌细胞的耦合进行监测。不过，俄勒冈州绿488 BAPTA - 1上午是一个非ratioable的Ca 2 +指示剂 ，因此不能轻易地被用来确定绝对的[Ca 2 +] i的。此外，它也可能缓冲的Ca 2 +如果存在高浓度，并成为高振幅变化的[Ca 2 +] i的饱和。
自发性收缩的抑制作用
自发收缩平滑肌机关可能减少，如药理，通过阻断运动的Ca 2 +通过L型Ca 2 +通道（例如通过：硝苯地平，地尔硫4）。请注意，这些药物将大大降低全细胞的Ca 2 +闪烁/瞬变的幅度。
输精管收缩输精管主要是嘌呤和去甲肾上腺素能神经递质结合的结果。然而，焦距的Ca 2 +在这个组织中的瞬变，去甲肾上腺素受体 阻断剂（如α1受体，哌唑嗪 5），这样的运动可减少不影响焦距的Ca 2 +瞬变不敏感。
另外，可能被阻止收缩，“下游”，通过抑制肌球蛋白轻链激酶如渥曼青霉素6。
结论
在亚微米分辨率的Ca 2 +荧光监测，是一个功能强大的技术来研究神经递质的释放5,7后交界的影响和释放的Ca 2 +从内部商店（如“ 火花 ”8 ）。分析的Ca 2 +瞬变的使用方法这里列出的成本效益比市售的图像分析软件包，可以通过自定义编写的Java插件ImageJ度身订造的分析。
Disclosures
作出了努力，以尽量减少使用动物的数量和他们的苦难，所有实验均按照英国动物（科学规程）行动1986年，欧洲共同体理事会指令86/09/EEC。
Acknowledgments
威康信托基金会提供财政支持（贵宾奖JSY和074128研究奖学金KLB）。医学研究理事会助学金，以RJA
Leica_SP2_Stacker，用于进口“重建”成系列的TIFF的算法，是基于Leica_tiff_sequence，读他的许可徕卡SP2的TIFF格式，由托尼柯林斯开发和使用在ImageJ插件。
（ http://www.uhnres.utoronto.ca/facilities/wcif/software/Plugins/LeicaTIFF.html ）StackReg和TurboReg，用正确的组织运动的算法，是基于钍venaz和他的同事（1998）9 。
Excel_writer.jar写由Kurt德沃斯（http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/excel-writer.html）。
JNCT0.08JoVE.ijm，粒子探测算法，是基于书面吉隆坡脑，以前5详细的算法。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Oregon Green 488 BAPTA-1 AM | Invitrogen | O6807 | 10 x 50 μg |
| Pluronic F-127 solution | Invitrogen | P3000MP | 20% solution in DMSO |
| Leica SP2 upright confocal microscope | Leica Microsystems | ||
| Air table (‘vibration isolated workstation’) | Newport Corp. | M-VW-3046-OPT-012140 | |
| Sylgard 184 elastomer | Dow Corning |
References
- Gregory, J. Indicators for Ca2+, Mg2+, Zn2+ and other metal ions. Handbook of fluorescent probes and research products. , Molecular Probes. Eugene, Oregon. 771-826 (2002).
- Boland, B., Himpens, B., Gillis, J. M., Casteels, R. Relationship between force and Ca2+ in anococcygeal and vas deferens smooth muscle cells of the mouse. Pflugers Arch. 421, 43-51 (1992).
- Hashitani, H., Fukuta, H., Takano, H., Klemm, M. F., Suzuki, H. Origin and propagation of spontaneous excitation in smooth muscle of the guinea-pig urinary bladder. J Physiol. 150, 273-286 (2001).
- Heppner, T. J., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Elementary purinergic Ca2+ transients evoked by nerve stimulation in rat urinary bladder smooth muscle. J. Physiol. 564, 201-212 (2005).
- Brain, K. L., Jackson, V. M., Trout, S. J., Cunnane, T. C. Intermittent ATP release from nerve terminals elicits focal smooth muscle Ca2+ transients in mouse vas deferens. J. Physiol. 541, 849-862 (2002).
- Fleichman, M., Schneider, T., Fetscher, C., Michel, M. C. Signal transduction underlying carbachol-induced contraction of rat urinary bladder II. Protein kinases. J. Pharmacol. Exp. Ther. 308, 54-58 (2004).
- Young, J. S., Meng, E., Cunnane, T. C., Brain, K. L. Spontaneous purinergic neurotransmission in the mouse urinary bladder. J. Physiol. 586, 5743-5755 (2008).
- Nelson, M. T., Cheng, H., Rubart, M., Santana, L. F., Bonev, A. D., Knot, H. J., Lederer, W. J. Relaxation of arterial smooth muscle by calcium sparks. Science. 270, 633-637 (1995).
- Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans. Image Process. 7, 27-41 (1998).
