Summary
Details methoden voor hoge-resolutie Ca
Abstract
Ca 2 + beeldvorming van het gladde spierweefsel geeft inzicht in cellulaire mechanismen die niet kan resulteren in veranderingen van de membraanpotentiaal, zoals de vrijlating van Ca 2 + van interne winkels, en maakt het mogelijk meerdere cellen tegelijkertijd worden gecontroleerd om, te beoordelen bijvoorbeeld, koppeling in syncytieel weefsel. Subcellulaire Ca 2 + transiënten komen vaak voor in de gladde spieren, maar zijn moeilijk nauwkeurig te meten, vanwege de problemen veroorzaakt door hun stochastische gebeurtenis, dan een vaak breed gezichtsveld, in een orgaan dat het gevoelig zijn voor contract. Om dit probleem te verhelpen, hebben we een serie van beeldvorming protocollen en analyse routines om vervolgens te verwerven en te analyseren, op een geautomatiseerde manier, de frequentie, de locatie en de amplitude van dergelijke gebeurtenissen. Hoewel deze aanpak kan worden toegepast in een andere context, onze eigen werk bestaat uit het opsporen van de lokale purinerge Ca 2 + transiënten voor het lokaliseren van de zender release met submicron-resolutie.
ATP is uitgebracht als een cotransmitter van de autonome zenuwen, waar het bindt aan P2X1 receptoren op de gladde spieren van de detrusor en de zaadleider. Ca 2 + komt in de gladde spieren, wat resulteert in purinerge neuroeffector Ca 2 + transiënten (NCTS). Het brandpunt Ca 2 + transiënten kan de optische controle van de neurotransmitters in een manier die veel voordelen ten opzichte van elektrofysiologie heeft. Afgezien van de sterk verbeterde ruimtelijke resolutie, optische recording heeft het extra voordeel dat de opname van de zender vrijlating uit een groot aantal te onderscheiden locaties tegelijk. Bovendien is de optische vlak van focus is makkelijker te onderhouden of te corrigeren tijdens de lange opname-serie dan is de herpositionering van een intracellulaire scherp micro-elektrode.
Samengevat, is een methode voor de beeldvorming van Ca 2 + fluorescentie geschetst waarin de details van de voorbereiding van de weefsel, en de verwerving en analyse van gegevens. Schetsen we het gebruik van meerdere scripts voor de analyse van dergelijke Ca 2 + transiënten.
Protocol
Deel 1: Voorbereiding van de Ca 2 +-indicator (Oregon Green 488 BAPTA-1 AM)
- Oregon Green 488 BAPTA-1 wordt geleverd AM in 500 pi flacons als een kleine hoeveelheid (50 ug) van poeder. Voeg 40 ul Pluronic F-127 oplossing voor het poeder, schudden zachtjes gedurende 30 s, voeg dan 460 ul PSS, en schud voorzichtig gedurende 30 s. De uiteindelijke oplossing, 10 uM Oregon Green 488 BAPTA-1 AM, geeft 4 x 125 ul aliquots. Vermijd blootstelling aan licht en op te slaan bij -20 C.
Deel 2: Ca 2 + geladen
- Verwijder de Ca 2 +-indicator (Oregon Green 488 BAPTA-1 AM) van de (-20 C) diepvries en laat ontdooien bij kamertemperatuur.
- Neem 1 ml van PSS in een reageerbuis en plaats in het water-bad. Bubble met 95% O 2 / 5% CO 2 met een snelheid van ongeveer 1 bubble verschijnen per seconde. De bubbler dient te worden bevestigd in de test-buis, bijv. met een stop of met Parafilm.
- Ontleden het weefsel van het dier, en in een Sylgard gevoerde petrischaal, verwijder voorzichtig bindweefsel. Onafhankelijk van de gladde spieren orgel type, moet PSS vervangen worden elke 10 minuten en weefsel moet goed worden gewassen (bijvoorbeeld door het vervangen van de PSS drie keer) na dissectie. Voor de zaadleider: denk aan het snijden van het orgel lengte manieren om een blad van het weefsel te produceren. Voor de urineblaas: open lengterichting van de blaashals (posterior) naar de top van de koepel (anterior). Bereiden vier strips, 6 - 8 mm lang en 1 - 2 mm breed, langs het dorsale oppervlak van de detrusor, het snijden in de richting van de dominante spier bundels.
- Plaats ontleed weefsel in de 'pre-verwarmd en borrelde' PSS.
- Voeg 125 ul van 10 uM Oregon Green 488 BAPTA-1 AM om de test-tube en geef een beetje schudden, met de hand, om te mengen.
- CV borrelen en laat, afgedekt met folie. De tijd is duurt voor voldoende weefsel te maken van de Ca 2 +-indicator varieert met de grootte van weefsel en de dikte van de gladde spierlaag. Bijvoorbeeld: 70 minuten (muis detrusor, rat anococcygeus) tot 120 min. (rat detrusor, muis vas deferens).
Deel 3: Voorbereiden van de 'Ca 2 + geladen' weefsel voor microscopie
Zorgvuldige pinning van het weefsel is nodig om spontane beweging van het weefsel (een eigenschap van de beeldvorming van de gladde spiercellen van relatief intact weefsel) te minimaliseren en om de locatie van een geschikte plaats voor de beeldvorming (als een plat stukje weefsel kan vergemakkelijken onderzocht in twee dimensies, in plaats van drie).
- Spoel het weefsel in borrelde PSS gedurende minstens 5 minuten.
- Mount in Sylgard gevoerde voorbereiding gerecht, dat zich uitstrekt van het weefsel (licht) om een vlakke plaat te vormen. Vermijd het gebruik van lange 'pinnen' dat het doel kan krassen, te gebruiken in plaats korte lengtes van 25-50 micrometer diameter zilverdraad als 'pinnen' en invoegen op een hoek.
- Plaats de schotel voorbereiding op de microscoop podium, zorg ervoor te zorgen dat de PSS niet ontsnappen aan de Sylgard omzoomde gebied van de schotel (omdat dit kan leiden tot een groot gebied worden behandeld in PSS, toen de superfusie begint).
- Schakel de pomp in om de voorbereiding superfuse met PSS. Een tarief van 100 ml per uur wordt vaak gebruikt.
- Schakel de verwarming unit.
- Plaats de in-en uitstroom buizen en temperatuursonde aan de voorbereiding schaal (het aanbrengen van elk van de metalen strip door de magneet op zijn basis). De hoogte van de tip van de uitstroom buis bepaalt de diepte van de PSS. Wees voorzichtig om ervoor te zorgen dat de uitstroom in feite is het verwijderen van PSS (omdat het soms niet in eerste instantie).
- Stel de temperatuur op de kachel unit op de gewenste temperatuur, bijvoorbeeld 33 tot 35 C. te bereiken
- Laat het weefsel in evenwicht gedurende minstens 10 minuten.
Deel 4: Keuze van de site om de afbeelding
Blootstelling aan excitatie verlichting zal de indicator photobleach, dus vermijd het gebruik van voor meer dan een paar seconden per keer.
- Met een laag vermogen doelstelling (10x of 20x) gebruik epifluorescentie, spannend met een blauw licht, om de gladde spieren te bekijken en een geschikte regio om toezicht te houden identificeren. Probeer een site op basis van pick: beweging (dat moet minimaal zijn) en het aantal van gladde spiercellen in het veld. Bright "structuren" kan een groot aantal 'false positives' in het beeld detectiealgoritme veroorzaken, dus vermijd sites met grote aantallen (bijvoorbeeld) afgewisseld epitheliale cellen of fibroblasten.
- Schakel over naar een hogere macht doelstelling (40x).
- Draai het podium of de optische as, zodat de gladde spiercellen (s) ligt horizontale (dat wil zeggen parallel aan de snelle scan as).
Deel 5: confocale microscopie
De details van hoe de confocale microscoop is 'set up' zijn specifiek voor elke microscoop type, maarde belangrijkste overwegingen zijn: snelheid (minimaal 5 Hz is vereist voor de meeste Ca 2 + overgangen), resolutie en grootte van het veld (die beide worden verhandeld-off met snelheid). Sommige van de volgende protocol is specifiek voor een Leica SP2 rechtop confocale microscoop. Een typische protocol is: 100 beeld-serie, verwierf op 5 Hz (256 x 256 pixels; ca. 100 x 100 micrometer.) Of 13,5 Hz (256 x 64 pixels, ca. 100 x 25 pm.). Het scannen kop ingesteld op bi-directioneel te verplaatsen (de verwerving snelheid te maximaliseren) en bij 1000 Hz per regel te verwerven.
- Sluit het gaatje om een 'luchtige disk'.
- Stel de laser (488 nm) de macht tussen de 25 en 35% op de AOTF: deze waarde wordt een trade-off tussen helderheid en fotobleking. (De laatste is vooral een probleem bij lange opnamen.)
- Verwerven zes series per site, en vier - zes vestigingen per 'behandeling'. Is het gebruikelijk om te streven naar dezelfde zes sites pre-drug (dat wil zeggen 'control') en post-drug monitor, hoewel ook hier belangrijke fotobleken kan de experimentator af te wijken van dit.
- Het is essentieel met Ca 2 + imaging dat de 'time controls' worden uitgevoerd.
Deel 6: Voorbereiding voor de analyse
- Download en installeer Image J uit: http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html. Download de platform-specifieke versie, en dan updaten naar de nieuwste versie van downloaden van de nieuwste imageJ.jar bestand van http://rsb.info.nih.gov/ij/upgrade/ij.jar, ter vervanging van het oude bestand. Apple Mac-gebruikers: als het werkt langzaam, zorg ervoor dat je de laatste versie van de Java Virtual Machine (JVM), verkrijgbaar bij Apple (http://www.apple.com/macosx/features/java/) gebruikt.
- Download Excel_writer.jar uit: http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/excel-writer.html en installeren in de Plugins [directory]> jar directory.
- Kopieer de volgende bestanden in de plugins directory: Leica_SP2_Stacker.class; JNCT0.08Release.ijm. Installeer elk van deze scripts met de Plugins [Menu]> Macro's> Install ... functie van ImageJ.
- We maken gebruik van een Leica SP2 confocale microscoop, de software (Leica LCS) waarvoor elke serie genereert als een zichtbaar 'movie' binnen de software, maar bespaart als individuele frames. Te reconstrueren frames in de serie: (i) Zorg ervoor dat alle 'frames' om gereconstrueerd te worden in een map (bijvoorbeeld 'DataFolder> Tiffs'). (Ii) Selecteer Plugins [Menu]> Macro's> Leica_SP2_Stacker. Selecteer de root directory (bijvoorbeeld 'DataFolder'). Selecteer de gewenste map in de drop-down lijst (bijvoorbeeld 'Tiffs /'). Selecteer een output directory of het genereren van een nieuwe (bijvoorbeeld 'DataFolder> Stacks'). Het script zal dan te reconstrueren series van individuele frames.
Deel 7: Correctie voor beweging
Hoewel beweging van de website afgebeeld kan worden geminimaliseerd met goede pinning en gelijkmatig-uitgerekt weefsel, sommige gladde spieren organen vertonen spontane weeën die niet kan worden opgeheven door een zorgvuldige pinnen alleen. Hier beschrijven we het gebruik van een vrij beschikbare algoritme dat aansluit of overeenkomt met frames in een serie.
- Download 'StackReg' (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) en 'TurboReg' (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/).
- Installeer elk in de Plugins map met behulp van de Plugins> Macro's> installeren ...
- Plaats een stapel om te worden verwerkt (File> Open ...) en vervolgens naar een frame dat duidelijk laat zien op het gebied van belang. Andere frames zullen worden afgestemd op dit referentiekader.
- Plugins> Stacks> StackReg. Probeer elk van de verschillende 'Transformaties' (dat wil zeggen Translation, Rigid Body, Geschaalde Rotation, Affine) om te bepalen wat het meest effectief is. (Meer informatie: http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/)
Deel 8: Particle detectie-algoritme
Voor elke 'site' belicht, zullen factoren variëren dat van invloed op de detectie van Ca 2 + transiënten. Door het meten van bepaalde eigenschappen van elke site ('particle parameters' - hieronder), is het proces van opsporing vergemakkelijkt. Dus voor elke site, een berekent 'drempel voor aftrek', 'drempel voor-ratio' en 'cell edge drempel'.
- Plugins [Menu]> Macro's> Install ... en selecteer 'JNCT0.08Release.ijm'.
- Plugins [Menu]> Macro's> belasting stack (sneltoets: l). Kies een serie en bereken deeltje parameters:
- a. Drempel voor afgetrokken (= achtergrond)
- Selecteer een rechthoekige ROI over wat je geloven 'achtergrond' te zijn.
- Measure (sneltoets: m). Noteer MEAN.
- b. Berekening van de drempel voor verhouding
- Selecteer een rechthoekigeROI rond een optisch vlakke oppervlakte van de cel (len).
- Measure (sneltoets: m). Noteer gemiddelde en de standaarddeviatie.
- Herhaal nog eens twee keer of je kunt tekenen drie dozen in een keer door op 'shift'.
- Berekenen en naar beneden drempel voor-ratio note = (1 + SD / gemiddelde) x 32, met een gemiddelde waarde van de drie herhalingen / sites.
- c. Cel rand drempel
- Afbeelding> Stacks> Z project ... Kies een projectie type: 'gemiddelde intensiteit'
- Afbeelding> Aanpassen> Drempel.
- Selecteer zwart en wit.
- Definieer 'onder' (bovenste slider) te beperken en noteer de overeenkomstige waarde (aan de rechterkant van de slider). Alleen gebeurtenissen die zich in de zwarte regio's zullen worden geteld.
- Klik op 'reset'.
- Analyse stacks (sneltoets: 2)
- Selecteer gewoon een serie in dit stadium, dat wil zeggen de 'eerste file' en 'laatste bestand' moet hetzelfde zijn.
- Voer waarden van de 'drempel voor aftrek', 'drempel voor-ratio' en 'cell edge drempel'. Laat andere instellingen op hun standaardwaarden.
- Het algoritme zal een dual-ruit venster waarin de verwerkte serie wordt weergegeven op de linker-en het origineel aan de rechterkant. Zorgvuldig gaan door dit om het aantal valse positieven en de keren dat gebeurtenissen, zichtbaar op het oog, niet zijn ontdekt beoordelen. Om een meer nauwkeurige detectie van Ca 2 + transiënten kan het nodig zijn om iets aan te passen een aantal van de 'particle parameters'. Terwijl het proces kan een beetje 'hit and miss' lijkt bij de eerste poging, krijgt men al snel een gevoel van wat parameters centraal staan.
- Voor elke serie, het algoritme produceert een Excel-bestand dat details de kenmerken van de gedetecteerde gebeurtenis (zoals amplitude, ruimte en positie). 'False positives' - geïdentificeerd door de herziening van de image-bestanden die het algoritme uitgangen (bijv. stap 8.17) - kunnen worden verwijderd, met de hand van dit Excel-bestand.
Discussion
Keuze uit fluorescerende Ca 2 +-indicator
Oregon Green 488 BAPTA-1 AM werd gekozen als de Ca 2 +-indicator, omdat het (i) is licht in vergelijking met andere indicatoren (bijv. Fluo-4 en Calcium Groen) 1, (ii) is gevoelig voor fysiologische veranderingen in Ca 2 +-concentratie met een K D van dezelfde orde van grootte 1 op de intracellulaire Ca 2 +-concentratie [Ca 2 +] i (bijvoorbeeld van vas deferens 2), (iii) laadt een groot aantal gladde spiercellen, waardoor gladde spiercellen koppeling te worden gecontroleerd. Echter, Oregon Green 488 BAPTA-1 AM is een non-ratioable Ca 2 +-indicator, en als zodanig niet gemakkelijk kan worden gebruikt om de absolute bepalen [Ca 2 +] i. Bovendien kan het ook buffer Ca 2 + indien aanwezig in hoge concentraties en wordt verzadigd met een hoge amplitude veranderingen in [Ca 2 +] i.
Remming van spontane contractiliteit
De spontane contractiliteit van de gladde spieren organen kunnen farmacologisch worden verminderd, bijvoorbeeld door het blokkeren van de beweging van Ca 2 + door de L-type Ca 2 +-kanalen (bijv. door: nifedipine 3; diltiazem 4). Merk op dat deze medicijnen sterk zal de amplitude van whole-cell Ca 2 + flitsen / transiënten te verminderen.
Contractie van de zaadleider resultaat van een combinatie van voornamelijk purinerge en noradrenerge neurotransmissie. Focus Ca 2 + transiënten in dit weefsel zijn echter ongevoelig voor noradrenerge receptor blokkade (bijv. α een adrenoceptor, door prazosine 5), zodat beweging kan worden verlaagd zonder dat dit invloed focale Ca 2 + transiënten.
Als alternatief kan samentrekking worden voorkomen 'downstream' door de remming van myosine lichte keten kinase, bijvoorbeeld door wortmannin 6.
Conclusies
Monitoring Ca 2 + fluorescentie bij submicron resolutie is een krachtige techniek om de post-junctionele effecten van neurotransmitters 5,7 bestuderen en het vrijkomen van Ca 2 + uit interne winkels (bijvoorbeeld 'vonken' 8). De analyse van Ca 2 + transiënten het gebruik van de beschreven methode is hier rendabel in vergelijking met commercieel verkrijgbare beeldanalyse pakketten en maakt het mogelijk op maat gemaakte analyse door middel van op maat geschreven Java-plug-ins voor ImageJ.
Disclosures
Pogingen werden gedaan om het aantal gebruikte dieren en hun lijden te minimaliseren; alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met het Verenigd Koninkrijk Dieren (wetenschappelijke procedures) Act 1986 en de Europese Gemeenschappen van Richtlijn 86/09/EEC.
Acknowledgments
De Wellcome Trust heeft financiële steun verleend (VIP Award uit aan JSY en 074.128 Research Fellowship aan KLB). Medical Research Council studententijd aan RJA
Leica_SP2_Stacker, een algoritme gebruikt om de TIFF's importeren voor 'reconstructie' in een reeks, is gebaseerd op Leica_tiff_sequence, een plugin voor het lezen van Leica SP2 TIFF's in ImageJ, ontwikkeld door Tony Collins en gebruikt met zijn toestemming.
( http://www.uhnres.utoronto.ca/facilities/wcif/software/Plugins/LeicaTIFF.html ) StackReg en TurboReg, zijn algoritmen die worden gebruikt om te corrigeren voor verplaatsing van weefsel, op basis van Th venaz en collega's (1998) 9.
Excel_writer.jar werd geschreven door Kurt De Vos (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/excel-writer.html).
JNCT0.08JoVE.ijm, het deeltje detectie-algoritme, is gebaseerd op een algoritme geschreven door KL Brain en eerder vijf gedetailleerd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Oregon Green 488 BAPTA-1 AM | Invitrogen | O6807 | 10 x 50 μg |
| Pluronic F-127 solution | Invitrogen | P3000MP | 20% solution in DMSO |
| Leica SP2 upright confocal microscope | Leica Microsystems | ||
| Air table (‘vibration isolated workstation’) | Newport Corp. | M-VW-3046-OPT-012140 | |
| Sylgard 184 elastomer | Dow Corning |
References
- Gregory, J. Indicators for Ca2+, Mg2+, Zn2+ and other metal ions. Handbook of fluorescent probes and research products. , Molecular Probes. Eugene, Oregon. 771-826 (2002).
- Boland, B., Himpens, B., Gillis, J. M., Casteels, R. Relationship between force and Ca2+ in anococcygeal and vas deferens smooth muscle cells of the mouse. Pflugers Arch. 421, 43-51 (1992).
- Hashitani, H., Fukuta, H., Takano, H., Klemm, M. F., Suzuki, H. Origin and propagation of spontaneous excitation in smooth muscle of the guinea-pig urinary bladder. J Physiol. 150, 273-286 (2001).
- Heppner, T. J., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Elementary purinergic Ca2+ transients evoked by nerve stimulation in rat urinary bladder smooth muscle. J. Physiol. 564, 201-212 (2005).
- Brain, K. L., Jackson, V. M., Trout, S. J., Cunnane, T. C. Intermittent ATP release from nerve terminals elicits focal smooth muscle Ca2+ transients in mouse vas deferens. J. Physiol. 541, 849-862 (2002).
- Fleichman, M., Schneider, T., Fetscher, C., Michel, M. C. Signal transduction underlying carbachol-induced contraction of rat urinary bladder II. Protein kinases. J. Pharmacol. Exp. Ther. 308, 54-58 (2004).
- Young, J. S., Meng, E., Cunnane, T. C., Brain, K. L. Spontaneous purinergic neurotransmission in the mouse urinary bladder. J. Physiol. 586, 5743-5755 (2008).
- Nelson, M. T., Cheng, H., Rubart, M., Santana, L. F., Bonev, A. D., Knot, H. J., Lederer, W. J. Relaxation of arterial smooth muscle by calcium sparks. Science. 270, 633-637 (1995).
- Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans. Image Process. 7, 27-41 (1998).
