Summary
Не-человеческое приматов является важным поступательное видов для нашего понимания нормальной обработки головного мозга. Анатомической организации мозга приматов может предоставить важную информацию о нормальных и патологических состояний у человека.
Abstract
Использование не человеческих приматов обеспечивает отличную поступательного модель для нашего понимания развития и процессы старения в организме человека
Protocol
Часть 1: Предварительная обработка тканей
- Ткань должна быть хорошо озарен параформальдегида, глутаральдегида или формалина. Это может быть достигнуто с помощью стандартных transcardial перфузии обычно используется для сбора других органов. В настоящем исследовании тема глубоко седативные с кетамин гидрохлорид (10 мг / кг, внутримышечно), эвтаназии с передозировкой натрия фенобарбитала (25 мг / кг, внутривенно) и перфузии transcardially 0,1 М PBS до полного exsanguinated.This следует на 4% параформальдегида решение в PBS в течение 5 мин (~ 1 литр).
Часть 2: стереотаксической блокировки
- Перед размещением голову в кадре стереотаксической координаты Horsley-Clarke/interaural нулевой плоскости должны быть приняты. Это теоретическая середина между ушами. Для измерения этой плоскости, ухо баров должны быть одинаково установлены в аппарате, затем поместите лезвие скальпеля в стереотаксического манипулятора и измерения средней точки между ухом баров. Это важно для определения, где блокировать ткани на основе исследований потребностей. Как только это будет завершена черепа необходимо быть готовым к фиксации в стереотаксического аппарата.
- Для того чтобы разместить голову в стереотаксическая рама нижняя челюсть должны быть удалены с костью rongeurs и скальпеля. Кроме того, кожа, мышцы и соединительную ткань должна быть удалена, чтобы разоблачить черепа. Как только соединительная ткань удаляется из черепа, подвергать мозг постепенное уничтожение черепа (табличной части затылочной кости, а также теменные, лобные кости объявление). В настоящей части эксперимента черепа имеет все готовы были удалены. Будьте осторожны, не полностью удалить височных костей, потому ушных каналов необходимо будет в целости и сохранности места голову в стереотаксической раме. Остальные вопрос оболочки должны быть удалены из открытых мозга. Череп теперь готовы быть помещены в стереотаксической раме.
- В том же порядке, в котором можно было бы выполнять стереотаксической хирургии, отрегулируйте глаза, неба и уха баров, что голова надежно фиксируется в стереотаксического аппарата. Место стереотаксического манипулятора в заданном передний / задний (/ P) координирует и переместите манипулятор для наружной стороны головного мозга. Медленно опустите лезвие в мозг, полностью поднять лезвие от мозга, а затем перейти медиально и нижнего лезвия снова. Повторите эти два шага, пока лезвие достигло наружной стороны противоположного полушария. Это завершает первый корональных блока. Для последующих корональных блоки двигать манипулятор 1 см в / P оси и повторять, пока весь мозг был заблокирован.
Часть 3: Удаление мозг от черепа
- Удалите головы от стереотаксической рамы и провести подвергается мозг в ладони. Постарайтесь обеспечить мозг, слегка размещения нянчиться мозга в ладони и оформить мизинец через лобные доли, это сводит к минимуму движение мозга в черепе. Для того, чтобы предотвратить высыхание пиальных поверхности мозга, место кусок PBS смоченной марлей через мозг. Держите голову крепко черепа и постепенно избавляться от оставшихся затылочной и височной кости вместе с позвоночником. Это подвергает базы и боковые стороны головного мозга. Наконец удалить все оставшиеся лобной кости и кости носа, которая позволит доступ к обонятельной луковицы. Важно, чтобы удалить лобной кости последний потому что, как вы удалите основания черепа мозг движется немного и лобных долей могут быть повреждены на зубчатые края Fontal кости. Срежьте и удалить оставшиеся оболочки материи. Аккуратно поднимите переднюю часть мозга, слайд-под скальпеля мозга и свободный мозг от черепа.
Часть 4: Измерения
- Есть ряд полезных измерений, которые могут быть сделаны до замораживания. Например, / P оси мозга с суппортом. Кроме того, удельная плотность может быть измерена путем взвешивания мозг, измерения объема по перемещению воды в мерный цилиндр последующим делением веса по объему перемещения (табл. 1).
Часть 5: Готово блокирование мозгом.
- Как правило, когда лезвие скальпеля вставляется в мозг она не достаточно долго, чтобы полностью проникнуть полный спинно-вентральной степени мозга. Как только мозг удаляют, а валовой измерений получены, возьмите ткани квантования лезвие и закончить блокирование мозгом через брюшную сторону мозга (рис. 2).
- До замораживания блоков, необходимо cryoprotect ткани в градуированных PBS-буферных растворах сахарозы (10, 20 и 30%) поддерживается на уровне 4 ˚ С до раковины мозга. Это обычно занимает ночной инкубации в 10%, 2-3 дней в 20%, а дополнительные 3-5 дней в 30% для блоков опускаются на дно сосуда. Ежедневная смена йE 30% раствором сахарозы рекомендуется.
Часть 6: Представитель Результаты
Есть ряд грубых морфологических измерений, которые могут быть сделаны как только мозг был удален из черепа. Они включают / P длины, веса и удельной плотности (табл. 1). Как правило, мы блок мозга в 6-7 блоков размером 1 см (рис. 1). Каждое изделие затем сфотографировали (рис. 2) и могут быть дополнительно расчлененные в зависимости от потребности в научных исследованиях или подготовленные для замораживания в градуированных решения сахарозы.
Тема | / P Длина (Мм) | Вес (В граммах) | Водоизмещение (Мл) | Удельная плотность (Г / мл) |
| O2303-2-1-1 | 64,3 | 28,1 | 24 | 1,171 |
| O5180-1 | 71,3 | 38,7 | 34 | 1,138 |
| O2708-3-1 | 62,8 | 28,7 | 26 | 1,104 |
| O9184-4-2 | 65,3 | 29,5 | 24 | 1,229 |
| N459-1-14-2 | 68,2 | 31,6 | 26 | 1,215 |
| СРЕДНЯЯ | 66,38 | 31,32 | 26,8 | 1,171 |
| STD DEV | 3,38 | 4,33 | 4,17 | 0,052 |
Таблица 1. Валовой Морфологические Измерения Right Hemisphere из 5 месяца Vervets
Рисунок 1. Схемы для корональных самолеты использовались для блокирования мозга. Это пример вовне мозга vervet взрослых. Пример блокирование процедуры. Вертикальные линии здесь располагается на 1 см, как правило, производит 7 корональные кварталах от каждого полушария.
Рисунок 2. Блоки мозговой ткани в стереотаксической пространства. Каждый блок даст около 200 разделов, принятые на 50 мкм. С помощью этой схемы выборки более 1200 разрезы коры будут предприняты и дополнительные 400-500 из мозжечка, когда нарезанный в поперечной плоскости.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Сент-Китс vervet (Chlorocebus aethiops sabeus) является Старый приматов мира с аналогичной модели и цены коры и подкорковых развитие мозга, что и люди. Этот вид был использован для моделирования сложных человеческих поведенческих расстройств, таких как беспокойство поведению, гипертония 8, 9 гемисферэктомия, болезни Паркинсона 10, болезнь Alzhemier в 11, и злоупотребление алкоголем 12. Совсем недавно, этот вид был использован для исследования нейроанатомической последствия натуралистической пренатальное воздействие этанола. Беременные vervets было разрешено пить эквивалент 3-5 стандартных доз алкоголя в четыре раза в неделю в течение третьего триместра беременности, и мы сообщаем, что существует 35%-ное снижение нейронов в лобной коре 13. Мозгов для этого исследования были stereotaxically заблокированы, так что только 3 из 7 блоков, необходимых для секционного завершить стереологического оценки лобной коре. Данная методика не ограничивается не-человеческого мозга приматов, но может быть продлен до мозга грызунов, а также. Например, если соматосенсорной коры крысы области интереса, стереотаксической сократить передней и задней в этот регион можно сделать с помощью кадра грызунов стереотаксической. Это обеспечивает небольшую область в отсек и стандартной фронтальной плоскости между животными. Важно отметить, что лезвие должно быть полностью отказался от мозга до того, средне-боковое движение производится с стереотаксического манипулятора иначе лезвие будет не-обязательно повреждения мозга.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Ikiel Ptito за его постоянную техническую поддержку. NSERC предоставлять депутат.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Scalpel | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | Any surgical scissors are sufficient |
| Rongeurs | Fine Science Tools | 16121-14 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Filter paper | Fisher Scientific | 09-924-150 | |
| Stereotaxic Frame | Kopf Instruments | ||
| Tissue slicing blade | Thomas Scientific |
References
- Gallagher, M., Rapp, P. R. The use of animal models to study the effects of aging on cognition. Annu Rev Psychol 48. , 339-370 (1997).
- Clancy, B., Darlington, R., Finlay, B. Translating developmental time across mammalian species. Neuroscience. 105, 7-17 (2001).
- Nowakowski, R. S., Rakic, P. The site of origin and route and rate of migration of neurons to the hippocampal region of the rhesus monkey. J Comp Neurol. 196, 129-154 (1981).
- Rakic, P., Bourgeois, J. P., Eckenhoff, M. F., Zecevic, N., Goldman-Rakic, P. S. Concurrent overproduction of synapses in diverse regions of the primate cerebral cortex. Science. 232, 232-235 (1986).
- Granger, B., Tekaia, F., Le Sourd, A. M., Rakic, P., Bourgeois, J. P. Tempo of neurogenesis and synaptogenesis in the primate cingulate mesocortex: comparison with the neocortex. J Comp Neurol. 360, 363-376 (1995).
- Zecevic, N., Rakic, P. Development of layer I neurons in the primate cerebral cortex. J Neurosci. 21, 5607-5619 (2001).
- Ervin, F. R., Palmour, R. M., Young, S. N., Guzman-Flores, C., Juarez, J. Voluntary consumption of beverage alcohol by vervet monkeys: population screening, descriptive behavior and biochemical measures. Pharmacol Biochem Behav. 36, 367-373 (1990).
- Palmour, R. M., Mulligan, J., Howbert, J. J., Ervin, F. Of monkeys and men: vervets and the genetics of human-like behaviors. Am J Hum Genet. 61, 481-488 (1997).
- Boire, D., Théoret, H., Ptito, M. Stereological evaluation of neurons and glia in the monkey dorsal lateral geniculate nucleus following an early cerebral hemispherectomy. Exp Brain Res. 142, 208-220 (2002).
- Bjugstad, K. B., Teng, Y. D., Redmond, D. E. J. r, Elsworth, J. D., Roth, R. H., Cornelius, S. K., Snyder, E. Y., Sladek, J. R. Jr Human neural stem cells migrate along the nigrostriatal pathway in a primate model of Parkinson's disease. Exp Neurol. 211, 362-369 (2008).
- Lemere, C. A., Beierschmitt, A., Iglesias, M., Spooner, E. T., Bloom, J. K., Leverone, J. F., Zheng, J. B., Seabrook, T. J., Louard, D., Li, D., Selkoe, D. J., Palmour, R. M., Ervin, F. R. Alzheimer's disease abeta vaccine reduces central nervous system abeta levels in a non-human primate, the Caribbean vervet. Am J Pathol. 165, 283-297 (2004).
- Mash, D. C., Staley, J. K., Doepel, F. M., Young, S. N., Ervin, F. R., Palmour, R. M. Altered dopamine transporter densities in alcohol-preferring vervet monkeys. Neuroreport. 7, 457-462 (1996).
- Burke, M. W., Palmour, R. M., Ervin, F. R., Ptito, M. Neuronal reduction in frontal cortex of primates after prenatal alcohol exposure. Neuroreport. 20, 13-17 (2009).
