Summary
Il primate non umano è una specie importante traslazionale per la nostra comprensione della normale elaborazione del cervello. L'organizzazione anatomica del cervello dei primati in grado di fornire spunti importanti in condizioni normali e patologiche nell'uomo.
Abstract
L'utilizzo di primati non umani fornisce un modello eccellente traslazionale per la nostra comprensione dei processi di sviluppo e di invecchiamento negli esseri umani
Protocol
Parte 1: Pre-trattamento dei tessuti
- Tessuto deve essere ben perfusi con paraformaldeide, glutaraldeide, o formalina. Questo può essere raggiunto attraverso standard di perfusione transcardial tipicamente usato per raccogliere altri organi. Nel presente studio il soggetto era profondamente sedato con cloridrato di ketamina (10 mg / kg, im), eutanasia con una dose eccessiva di sodio pentobarbital (25 mg / kg, iv) e perfusi transcardially con 0,1 M PBS fino a completo exsanguinated.This è seguito da una soluzione di paraformaldeide al 4% in PBS per 5 min (~ 1 litro).
Parte 2: Stereotassica blocco
- Prima di mettere la testa nel frame stereotassico le coordinate dello zero Horsley-Clarke/interaural aereo deve essere preso. Questo è il punto medio teorico tra le orecchie. Per misurare questo piano, le barre orecchio devono essere ugualmente montato l'apparecchio, poi posto una lama di bisturi nel braccio manipolatore stereotassica e misurare il punto medio tra le sbarre orecchio. Questo è importante per determinare dove per bloccare il tessuto in base alle esigenze di ricerca. Una volta che questo è completato il cranio deve essere preparato per la fissazione nell'apparecchio stereotassica.
- Al fine di posizionare la testa nel frame stereotassico la mascella inferiore dovrà essere rimosso con Rongeurs osso e un bisturi. Inoltre la pelle, muscoli e tessuto connettivo deve essere rimosso al fine di esporre il cranio. Una volta che il tessuto connettivo viene rimosso dal cranio, esporre il cervello intaccando il calvaria (la parte tabellare dell'osso occipitale e parietale, le ossa ad frontale). Nella parte presente esperimento della calvaria è tutto pronto stato rimosso. Fare attenzione a non rimuovere completamente le ossa temporali, perché il canale uditivo dovrà essere intatto per posizionare la testa nel telaio stereotassico. La questione restante durata dovrebbe essere rimosso dal cervello esposto. Il cranio è ora pronto per essere inserito nel telaio stereotassico.
- Nello stesso modo in cui si effettuerebbe un intervento di chirurgia stereotassica, regolare l'occhio, il palato, e bar orecchio in modo che la testa è saldamente fissato l'apparato stereotassico. Posizionare il manipolatore stereotassica nelle coordinate predeterminato anteriore / posteriore (A / P) e spostare il manipolatore alla faccia laterale del cervello. Abbassare lentamente la lama nel cervello, completamente sollevare la lama dal cervello, quindi spostare medialmente e abbassare la lama di nuovo. Ripetere questi due passi fino a quando la lama ha raggiunto la superficie laterale dell'emisfero opposto. Questo completa il primo blocco coronale. Per i successivi blocchi coronale spostare i 1cm manipolatore in asse A / P e ripetere fino a tutto il cervello è stato bloccato.
Parte 3: Rimozione del cervello dal cranio
- Togliere la testa dal telaio stereotassico e tenere il cervello esposti nel palmo della vostra mano. Provate a fissare il cervello con una leggera ponendo vezzeggiare il cervello nel palmo della tua mano e il dito mignolo tra i lobi frontali, questo movimento minimizza del cervello nel cranio. Al fine di evitare l'essiccamento della superficie piale del cervello, posto un pezzo di garza imbevuto PBS in tutto il cervello. Tenere la testa saldamente dal cranio e sgretolare le ossa rimanenti occipitale e temporale insieme alla colonna vertebrale. Questo espone gli aspetti di base e laterale del cervello. Infine togliere qualunque osso residuo frontale e l'osso nasale, che permetterà l'accesso ai bulbi olfattivi. E 'importante rimuovere l'osso frontale ultima perché, come si rimuove la base del cranio, il cervello e si muove leggermente i lobi frontali possono essere danneggiati ai bordi frastagliati delle ossa fontale. Tagliare e rimuovere i restanti materia dura. Sollevare con cautela la parte anteriore del cervello, far scorrere il bisturi sotto il cervello e liberare il cervello dal cranio.
Parte 4: Misure
- Ci sono una serie di misure utili che possono essere fatte prima del congelamento. Ad esempio, l'asse A / P del cervello con una pinza. Inoltre la densità specifica può essere misurata dal peso del cervello, misurazione del volume dallo spostamento d'acqua in un cilindro graduato poi dividendo il peso per il dislocamento del volume (Tabella 1).
Parte 5: Fine bloccando il cervello.
- In genere quando il bisturi viene inserito nel cervello non è abbastanza a lungo per penetrare completamente l'intero dorso-ventrale misura del cervello. Una volta che il cervello viene rimosso e le misurazioni sono ottenute lordo, prendere un tessuto-slicing lama e finire bloccando il cervello attraverso il lato ventrale del cervello (Figura 2).
- Prima del congelamento dei blocchi, è necessario cryoprotect il tessuto in PBS graduato-buffered soluzioni di saccarosio (10, 20, e 30%) hanno mantenuto a 4 ˚ C fino a quando il cervello affonda. Ci vuole in genere una notte di incubazione a 10%, 2-3 giorni nel 20% e ulteriori 3-5 giorni nel 30% per i blocchi a depositarsi sul fondo del contenitore. Un cambio giornaliero di secolosoluzione di saccarosio e 30% è raccomandato.
Parte 6: Risultati Rappresentante
Ci sono una serie di gravi misure morfologiche che possono essere fatte una volta che il cervello è stato rimosso dal cranio. Questi includono un rapporto lunghezza / P, il peso e la densità specifica (Tabella 1). In genere bloccare il cervello in 6-7 blocchi di misura 1cm (Figura 1). Ogni pezzo viene poi fotografato (Figura 2) e può essere ulteriormente sezionato a seconda delle esigenze di ricerca o pronti per essere congelati in soluzioni di saccarosio classificato.
Soggetto | A Lunghezza / P (Mm) | Peso (Grammi) | Acqua Cilindrata (Ml) | Densità specifica (G / ml) |
| O2303-2-1-1 | 64,3 | 28,1 | 24 | 1,171 |
| O5180-1 | 71,3 | 38,7 | 34 | 1,138 |
| O2708-3-1 | 62,8 | 28,7 | 26 | 1,104 |
| O9184-4-2 | 65,3 | 29,5 | 24 | 1,229 |
| N459-1-14-2 | 68,2 | 31,6 | 26 | 1,215 |
| MEDIA | 66,38 | 31,32 | 26,8 | 1,171 |
| STD DEV | 3,38 | 4,33 | 4,17 | 0,052 |
Tabella 1. Misure lordo morfologica della Right Hemisphere su 5 cercopitechi mesi
Figura 1. Schemi per i piani coronali utilizzato per bloccare il cervello. Questo è un esempio di un cervello esteriorizzato vervet adulto. Esempio della procedura di blocco. Le linee verticali qui sono distanziati di 1 cm, di solito produce 7 blocchi coronale da ciascun emisfero.
Figura 2. Blocchi di tessuto cerebrale nello spazio stereotassico. Ciascun blocco produrrà circa 200 sezioni prese a 50 micron. Con questo schema di campionamento oltre 1200 sezioni attraverso la corteccia sarà presa e un ulteriore 400-500 dal cervelletto al taglio nel piano coronale.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Il St. Kitts cercopiteco (Chlorocebus aethiops sabeus) è un primate del Vecchio Mondo, con modelli simili e tassi di sviluppo del cervello corticali e sottocorticali a quella degli esseri umani. Questa specie è stata usata per modellare complessi disturbi del comportamento umano come comportamento ansioso, ipertensione 8, emisferectomia 9, 10 morbo di Parkinson, il morbo di Alzhemier il 11 e l'abuso di alcool 12. Più recentemente, questa specie è stata utilizzata per studiare gli effetti neuroanatomici di etanolo naturalistico esposizione prenatale. Cercopitechi incinta sono stati autorizzati a bere l'equivalente di 3-5 porzioni standard quattro volte alla settimana durante il terzo trimestre e si segnala che vi è una riduzione del 35% dei neuroni nella corteccia frontale 13. I cervelli di questo studio sono stati bloccati stereotaxically tale che solo 3 dei 7 isolati bisogno di essere sezionato per completare la valutazione stereological della corteccia frontale. Questa particolare tecnica non si limita al non umano cervello dei primati, ma può essere estesa a cervello di roditori pure. Per esempio, se la corteccia somatosensoriale di un ratto è la regione di interesse, un taglio stereotassico anteriore e posteriore a quella regione può essere presentata utilizzando il telaio stereotassico roditori. Questo fornisce una piccola regione di sezione e di un piano standard coronale tra gli animali. E 'importante notare che la lama deve essere completamente ritirato dal cervello prima di qualsiasi movimento di medio-laterale è realizzato con il manipolatore stereotassico altrimenti la lama non-necessariamente danneggiare il cervello.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare Ikiel Ptito per il suo continuo supporto tecnico. NSERC concedere a MP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Scalpel | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | Any surgical scissors are sufficient |
| Rongeurs | Fine Science Tools | 16121-14 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Filter paper | Fisher Scientific | 09-924-150 | |
| Stereotaxic Frame | Kopf Instruments | ||
| Tissue slicing blade | Thomas Scientific |
References
- Gallagher, M., Rapp, P. R. The use of animal models to study the effects of aging on cognition. Annu Rev Psychol 48. , 339-370 (1997).
- Clancy, B., Darlington, R., Finlay, B. Translating developmental time across mammalian species. Neuroscience. 105, 7-17 (2001).
- Nowakowski, R. S., Rakic, P. The site of origin and route and rate of migration of neurons to the hippocampal region of the rhesus monkey. J Comp Neurol. 196, 129-154 (1981).
- Rakic, P., Bourgeois, J. P., Eckenhoff, M. F., Zecevic, N., Goldman-Rakic, P. S. Concurrent overproduction of synapses in diverse regions of the primate cerebral cortex. Science. 232, 232-235 (1986).
- Granger, B., Tekaia, F., Le Sourd, A. M., Rakic, P., Bourgeois, J. P. Tempo of neurogenesis and synaptogenesis in the primate cingulate mesocortex: comparison with the neocortex. J Comp Neurol. 360, 363-376 (1995).
- Zecevic, N., Rakic, P. Development of layer I neurons in the primate cerebral cortex. J Neurosci. 21, 5607-5619 (2001).
- Ervin, F. R., Palmour, R. M., Young, S. N., Guzman-Flores, C., Juarez, J. Voluntary consumption of beverage alcohol by vervet monkeys: population screening, descriptive behavior and biochemical measures. Pharmacol Biochem Behav. 36, 367-373 (1990).
- Palmour, R. M., Mulligan, J., Howbert, J. J., Ervin, F. Of monkeys and men: vervets and the genetics of human-like behaviors. Am J Hum Genet. 61, 481-488 (1997).
- Boire, D., Théoret, H., Ptito, M. Stereological evaluation of neurons and glia in the monkey dorsal lateral geniculate nucleus following an early cerebral hemispherectomy. Exp Brain Res. 142, 208-220 (2002).
- Bjugstad, K. B., Teng, Y. D., Redmond, D. E. J. r, Elsworth, J. D., Roth, R. H., Cornelius, S. K., Snyder, E. Y., Sladek, J. R. Jr Human neural stem cells migrate along the nigrostriatal pathway in a primate model of Parkinson's disease. Exp Neurol. 211, 362-369 (2008).
- Lemere, C. A., Beierschmitt, A., Iglesias, M., Spooner, E. T., Bloom, J. K., Leverone, J. F., Zheng, J. B., Seabrook, T. J., Louard, D., Li, D., Selkoe, D. J., Palmour, R. M., Ervin, F. R. Alzheimer's disease abeta vaccine reduces central nervous system abeta levels in a non-human primate, the Caribbean vervet. Am J Pathol. 165, 283-297 (2004).
- Mash, D. C., Staley, J. K., Doepel, F. M., Young, S. N., Ervin, F. R., Palmour, R. M. Altered dopamine transporter densities in alcohol-preferring vervet monkeys. Neuroreport. 7, 457-462 (1996).
- Burke, M. W., Palmour, R. M., Ervin, F. R., Ptito, M. Neuronal reduction in frontal cortex of primates after prenatal alcohol exposure. Neuroreport. 20, 13-17 (2009).
