Summary
Banques de cerveaux et l'échantillonnage systématique de matériel biologique fournit la base pour stéréologie impartiale et maximise le potentiel des données obtenues de chaque spécimen.
Abstract
Stéréologie impartiale est une méthode précise et efficace pour l'estimation du nombre de neurones totale (ou autre type cellulaire) dans une zone donnée d'intérêt
Protocol
Partie 1: Pré-traitement des tissus
- Les tissus doivent être bien perfusés avec du paraformaldéhyde, glutaraldéhyde, ou du formol. Ceci peut être réalisé grâce à la perfusion transcardial norme généralement utilisée pour la récolte d'autres organes. Dans l'étude actuelle, l'objet a été profondément sédatés avec le chlorhydrate de kétamine (10 mg / kg, im), euthanasiés avec une overdose de pentobarbital sodique (25 mg / kg, iv) et perfusé transcardiaque avec PBS 0,1 M jusqu'à ce que complètement exsangue. Il est suivi par une solution de paraformaldéhyde 4% dans du PBS pendant 5 min (~ 1 litre).
- Le cerveau doit être bloquée stéréotaxique, retiré du crâne, pesés, et volume déterminé 2. Le tissu doit ensuite être cryoprotégés dans les solutions de saccharose gradué avec une concentration finale de saccharose à 30% dans un tampon phosphate. Les blocs de tissus devrait ensuite être congelé dans l'isopentane à -65 ° C et conservés à -80 ° C jusqu'à ce que vous êtes prêt à trancher.
Partie 2: Échantillonnage systématique
- L'échantillonnage systématique s'appuie sur un bon plan avant la coupe. L'ensemble de la région d'intérêt dans les deux degrés rostrale-caudale et dorsale-ventrale doit être bien défini. Un atlas stéréotaxique de l'espèce dans l'utilisation est utile de définir la région d'intérêt et de déterminer la longueur de la région d'intérêt. Une fois la longueur de la région d'intérêt est déterminé, il est nécessaire d'établir l'intervalle d'échantillonnage. Par exemple, à partir de l'atlas stéréotaxique vous constatez que l'ensemble rostro-caudale étendue de la région d'intérêt est d'environ 3 mm de longueur lors de sectionnement dans le plan coronal. Vous décidez alors de mettre le cryostat à la section 50 microns au, à ce rythme vous aurez 60 sections couvrant l'étendue rostrale-caudale de la région d'intérêt. Pour une étude typique stéréologiques impartiale 6-10 sections systématiquement échantillonnés sont nécessaires pour obtenir des résultats fiables. Dans cet exemple 10 sections équidistantes à travers le résultat mesure rostro-caudale dans un intervalle d'échantillonnage de 1 / 6 sections.
Partie 3: Création de la banque de cerveaux
- Une fois la fréquence d'échantillonnage section a été déterminée, la prochaine étape est de déterminer ce qui taches seront effectuées immédiatement. Par exemple, si vous êtes coloration au crésyl violet vous allez capturer sixième sections sur une diapositive. Ce sera la série 1. Si vous savez qu'il ya peut-être plusieurs anticorps potentiels que vous souhaitez courir, mais soit souhaitez voir les données que votre principale fournit une teinture ou n'ont tout simplement pas le temps d'effectuer l'immunohistochimie, placer le solde de 5 séries de sections dans l'ordre où elles ont été tranchés en préserver les puits contenant l'antigène (1 polyvinylpyrrolidone%, l'éthylène glycol de 50% dans o.1M PBS, pH 7,4). Le tableau ci-dessous donne un schéma d'échantillonnage composé d'une lame et une plaque (standard plaque à 48 puits) de sections dans le cadre d'une banque de cerveaux (tableau 1).
Tableau 1. La fréquence d'échantillonnage la section est ici de 1 / 6. La première section est placée sur une lame pour la coloration de violet de crésyl et les 5 prochaines sections sont placées dans des antigènes préserver. 7 Numéro de section est ensuite capturé sur la diapositive et les sections 9-12 sont placés dans des antigènes préserver. Ce cycle est répété jusqu'à ce que la région d'intérêt ou de bloc de tissu est sectionné de façon exhaustive. - La prochaine étape est de manière exhaustive la section du bloc de tissu. Placer une petite quantité d'intégrer support sur le mandrin et laisser geler. Placez le mandrin dans la tête de microtome et raser assez du milieu congelé pour avoir une surface plane. Retirez le mandrin de la tête et le lieu microtome à plat dans le cryostat. Verser intégrant support sur le mandrin et fermement placer le bloc du cerveau avec le côté coupé stéréotaxique positionnés à plat sur le mandrin. Lentement et complètement intégrer le cerveau en milieu de montage. Placez le mandrin avec le cerveau dans la tête de microtome et la section en utilisant les paramètres pré-déterminé pour la fréquence d'échantillonnage article.
- Une fois le bloc de tissu a été sectionné et exhaustive sections sont placées dans des puits, recouvrir la plaque avec le couvercle, le couvercle envelopper avec du parafilm, et placer dans un congélateur à -20 ° C. Connexion au nombre total de sections prises pour chaque série, l'intervalle de la section d'échantillonnage et le nombre de séries pour chaque animal. Ce journal sera vital de garder la trace de l'élimination ultérieure des sections de la banque de cerveaux pour l'immunohistochimie avenir.
Partie 4: Résultats du représentant:
L'échantillonnage systématique de cette manière a été une pratique courante dans notre laboratoire pour les 3 dernières années. Nous avons eu beaucoup de succès immunohistochimie effectuer sur le matériel qui a été stocké dans antigène préserver trois ans après qu'il a été tranché sans détérioration du signal (figure 1). Par ailleurs, dans le cadre de notre banque de cerveaux que nous avons enregistré près de 20 000 sections systématique des non-humainscerveau de primate (figure 2) dans le cadre de nos plans de recherche à long terme. 
Figure 1. Ceci est une section du pôle occipital du primate non humain immunocolorées pour NeuN montrant deux couches VI et interstitielle neurones de la substance blanche. Cette section particulière a été stocké dans antigène conserver à -20 ° C pendant une période de 2 ans. Barre d'échelle = 100 microns. 
Figure 2. Notre banque de cerveaux vervet se compose désormais de près de 20 000 sections systématiques de plus de 30 singes.
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Discussion
L'échantillonnage systématique est une méthode peu coûteuse destinée à optimiser le matériel de recherche. Cette stratégie d'échantillonnage est conçu pour se conformer aux règles du stéréologie impartiale qui nécessite un échantillonnage systématique de toute la région. Il est essentiel que l'ordre des sections pour chaque série est maintenue. Dans notre laboratoire, nous avons utilisé avec succès cette méthode pour les services bancaires à la fois de hamster et non-humains des coupes de cerveau de primate. Jusqu'ici, nous avons recueilli des coupes de cerveau près de 20.000 singe vervet (aethiops Chlorocebus sabeus) et effectuer systématiquement immunohistochimie sur des sections qui ont été stockées pendant plus d'un an. Les avantages d'une banque bien caractérisés du cerveau comprennent la possibilité de collecter des données entre les décisions de financement, la capacité pour les nouveaux étudiants de collecter rapidement des données et de minimiser l'utilisation et le traitement des nouveaux animaux maximisant ainsi les fonds de recherche.
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Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier pour son Ikiel Ptito appui technique continu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethylene glycol | Fisher Scientific | E178-4 | |
| Polyvinyl pyrrolidone | Fisher Scientific | BP431-500 | |
| Thermal Scientific Embedding Medium | Fisher Scientific |
References
- West, M., Slomianka, L., Gundersen, H. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. Aat Rec. 231, 482-497 (1991).
- Burke, M. W., Zangenehpour, S., Boire, D., Ptito, M. Dissecting the Non-human Primate Brain in Stereotaxic Space. J Vis Exp. , (2009).
