Summary
Brain bank och systematisk provtagning av biologiskt material utgör grunden för objektiva stereology och maximerar de potentiella uppgifter som erhålls från varje prov.
Abstract
Objektiva stereology är en metod för korrekt och effektivt beräkna det totala neuron nummer (eller annan celltyp) i ett visst område av intresse
Protocol
Del 1: Förbehandling av vävnad
- Vävnad skall vara väl perfusion med paraformaldehyd, glutaraldehyd eller formalin. Detta kan uppnås genom vanliga transcardial perfusion vanligtvis används för att skörda andra organ. I den aktuella studien i ämnet var djupt sederad med ketamin hydroklorid (10 mg / kg im), avlivas med en överdos av natrium pentobarbital (25 mg / kg, iv) och perfusion transcardially med 0,1 M PBS tills det är helt exsanguinated. Detta följs av en 4% paraformaldehyd lösning i PBS i 5 min (~ 1 liter).
- Hjärnan bör vara stereotaxically blockeras avlägsnats från skallen, vägas och volym som beräknats 2. Vävnaden bör då cryoprotected i graderade sackaros lösningar med en slutlig koncentration av 30% sackaros i fosfatbuffert. Block av vävnad bör då frysas i isopentan vid -65 ° C och förvaras vid -80 ° C tills du är redo att skära.
Del 2: Systematisk provtagning
- Systematisk provtagning bygger på en ordentlig plan för innan snittning. Hela regionen av intresse i både rostralt-stjärt och rygg-ventrala utsträckning bör vara väl definierat. En stereotaxic atlas av de arter som används är till hjälp för att definiera regionen av intresse och för att bestämma längden av regionen av intresse. När längden på regionen av intresse avgörs är det nödvändigt att fastställa de provtagnings-intervallet. Till exempel från stereotaxic atlasen dig att bestämma att hela Rostro-caudal omfattningen av regionen av intresse är cirka 3 mm i längd när sektionering i coronal planet. Du bestämmer sedan att ställa in kryostat avsnitt på 50μm, i denna takt kommer du att ha 60 avsnitt som täcker rostralt-caudal omfattningen av regionen av intresse. För en typisk objektiva stereological studie 6-10 provtas systematiskt sektionerna krävs för att få tillförlitliga resultat. I detta exempel 10 avsnitt fördelade jämnt över hela Rostro-caudal utsträckning resultera i ett samplingsintervall av 1 / 6 sektioner.
Del 3: Inrättande av hjärnan banken
- När avsnittet samplingsfrekvensen har fastställts är nästa steg att bestämma vilka fläckar kommer att genomföras omedelbart. Till exempel, om du är färgning med Cresyl violett du kommer att ta 1 / 6 avsnitt på en bild. Detta kommer att serie 1. Om du vet att det kanske flera potentiella antikroppar som du vill köra, men antingen vill se de data som din primära fläcken tillhandahåller eller helt enkelt inte har tid att utföra immunohistokemi, placera de resterande 5 serie avsnitt i den ordning de var skivad i brunnar innehållande antigen bevara (1% polyvinyl pyrrolidon, 50% etylenglykol i o.1M PBS, pH 7,4). I tabellen nedan ges en undersökningsplan som består av en bild och en platta (standard 48-brunnar) av delar som en del av en hjärna bank (tabell 1).
Tabell 1. Avsnittet Samplingsfrekvensen här är 1 / 6. Den första delen är placerad på en bild för Cresyl violett färgning och nästa 5 sektionerna placeras i antigen bevara. Avsnitt nummer 7 är sedan fångas på bild och 9-12 § § är placerade i antigen bevara. Denna cykel upprepas tills regionen av intresse eller ett block av vävnad är uttömmande snittades. - Nästa steg är att uttömmande avsnitt blocket av vävnad. Placera en liten mängd bädda medium på chucken och låt den frysa. Placera chucken i mikrotomen huvudet och raka bort tillräckligt mycket av den frysta mediet att ha en plan yta. Ta bort chucken från mikrotomen huvudet och placera platt inom kryostat. Häll bädda medium på chuck och fast plats i hjärnan blocket med stereotaxically skurna sidan placeras plant på chucken. Långsamt och helt bädda in hjärnan i monteringsmedel. Placera chuck med hjärnan i mikrotomen huvudet och avsnitt med förbestämda parametrar för avsnittet samplingsfrekvens.
- När block av vävnad har genomgått omfattande sektioneras och sektionerna placeras i brunnar, täcka plattan med locket, wrap locket med parafilm, och lägg i en -20 ° C frys. Logga in det totala antalet sektioner tas för varje serie, avsnittet provtagning intervall och antalet serier för varje djur. Denna logg kommer att vara avgörande för att hålla reda på avlägsnande av delar från hjärnan banken för framtida immunohistokemi.
Del 4: representativa resultat:
Systematiskt stickprov på detta sätt har varit en praxis i vårt laboratorium för de 3 senaste åren. Vi har haft en stor framgång utföra immunohistokemi på material som har lagrats i antigen bevara tre år efter det var skivad utan försämring av signalen (Figur 1). Dessutom, som en del av vår hjärna bank vi har loggat nära till 20.000 systematiska delar av icke-mänskligaprimat hjärnan (figur 2) som en del i vår långsiktiga forskningsplaner. 
Figur 1. Detta är ett avsnitt från occipital polen av den icke-mänskliga primater immunostained för Neun visar både lager VI och interstitiell vita nervceller frågan. Detta särskilt avsnitt lagrades i antigen bevara vid -20 ° C under en period av två år. Skala bar = 100μm. 
Figur 2. Vår vervet Hjärnbanken nu består av nästan 20 tusen systematiska avsnitt från över 30 apor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Systematisk provtagning är en billig metod som syftar till att maximera forskningsmaterial. Denna provtagning strategi är utformad för att uppfylla reglerna för objektiva stereology som kräver systematisk provtagning i hela regionen. Det är avgörande att ordningen på avsnitten för varje serie bibehålls. I vårt laboratorium har vi framgångsrikt använt denna metod för bank både hamster och icke-mänskliga primater delar hjärnan. Hittills har vi samlat nära till 20.000 grön markatta (Chlorocebus aethiops sabeus) hjärnan sektioner och rutinmässigt utför immunohistochemisty på sektioner som har lagrats i över ett år. Fördelarna med ett präglat väl Hjärnbanken inkludera möjligheten att samla in data mellan beslut om finansiering, möjlighet för nya studenter att snabbt samla in data och minimera användningen och behandlingen av nya djur därigenom maximera forskningsmedel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Ikiel Ptito för hans fortsatta teknisk support.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethylene glycol | Fisher Scientific | E178-4 | |
| Polyvinyl pyrrolidone | Fisher Scientific | BP431-500 | |
| Thermal Scientific Embedding Medium | Fisher Scientific |
References
- West, M., Slomianka, L., Gundersen, H. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. Aat Rec. 231, 482-497 (1991).
- Burke, M. W., Zangenehpour, S., Boire, D., Ptito, M. Dissecting the Non-human Primate Brain in Stereotaxic Space. J Vis Exp. , (2009).
