Summary
Brain bank-en systematische bemonstering van biologisch materiaal vormt de basis voor onpartijdige stereology en maximaliseert de mogelijkheden gegevens van elk exemplaar.
Abstract
Onpartijdige stereology is een methode voor het nauwkeurig en efficiënt schatting van het totaal aantal neuron (of een ander celtype) in een bepaald gebied van belang
Protocol
Deel 1: Pre-verwerking van weefsel
- Weefsel moet goed worden geperfuseerd met paraformaldehyde, glutaaraldehyde, of formaline. Dit kan worden bereikt door middel van standaard transcardial perfusie meestal gebruikt om andere organen te oogsten. In de huidige studie het onderwerp was diep gesedeerd met ketamine hydrochloride (10 mg / kg, im), gedood met een overdosis natrium pentobarbital (25 mg / kg, iv) en perfusie transcardially met 0,1 M PBS tot het volledig exsanguinated. Dit wordt gevolgd door een 4% paraformaldehyde oplossing in PBS gedurende 5 minuten (~ 1 liter).
- De hersenen moeten stereotaxically worden geblokkeerd, verwijderd uit de schedel, gewogen, en het volume bepaald 2. Het weefsel moet dan cryoprotected in gesorteerd sucrose oplossingen met een uiteindelijke concentratie van 30% sucrose in fosfaatbuffer. Blokken van weefsel moet dan worden bevroren in isopentaan bij -65 ° C en opgeslagen bij -80 ° C tot u klaar bent om te snijden.
Deel 2: systematische bemonstering
- Systematische steekproef is gebaseerd op een goed plan voorafgaand aan snijden. De hele regio van belang, zowel in de rostrale-caudale en dorsale-ventrale mate moet goed worden gedefinieerd. Een stereotaxische atlas van de soorten in gebruik is nuttig om de regio van belang te definiëren en de lengte van de regio van belang vast te stellen. Zodra de lengte van de regio van belang is bepaald is het noodzakelijk om de sampling interval vast te stellen. Bijvoorbeeld, uit de atlas stereotaxische bepaalt u dat de hele rostro-caudale de omvang van de regio van belang is ongeveer 3 mm in de lengte als snijden in het frontale vlak. U kunt vervolgens beslissen om de cryostaat ingesteld om sectie op 50μm, in dit tempo heb je 60 secties met betrekking tot de rostrale-caudale de omvang van de regio van belang. Voor een typische onpartijdige stereological studie 60-10 systematisch bemonsterd secties nodig zijn om betrouwbare resultaten te verkrijgen. In dit voorbeeld 10 delen gelijkmatig verspreid over de rostro-caudale mate resulteren in een sampling interval van 1 / 6 secties.
Deel 3: Oprichting van de hersenen bank
- Zodra de sectie sampling frequentie is vastgesteld, is de volgende stap is om te bepalen welke vlekken zal onmiddellijk worden uitgevoerd. Bijvoorbeeld, als u kleuren met cresyl violet u vastleggen 1 / 6 onderdelen op een dia. Dit wordt een serie. Als u weet dat er misschien verschillende potentiële antilichamen die je zou willen lopen, maar of de gegevens wilt zien dat uw primaire vlek geeft of simpelweg niet de tijd om de immunohistochemie uit te voeren, de resterende 5-serie van secties plaats in de volgorde waarin ze werden gesneden in putten met het antigen te behouden (1% polyvinylpyrrolidon, 50% ethyleenglycol in o.1M PBS, pH 7,4). De onderstaande tabel geeft een bemonsteringsschema, bestaande uit een glijbaan en een plaat (standaard 48-well plaat) van delen, als onderdeel van een brain bank (tabel 1).
Tabel 1. De sectie bemonsteringsfrequentie hier is 1 / 6. Het eerste deel is geplaatst op een glijbaan voor cresyl violet kleuren en de volgende vijf hoofdstukken worden geplaatst in antigeen te behouden. Sectie nummer 7 wordt vervolgens opgevangen op de dia en delen 9-12 zijn geplaatst in antigeen te behouden. Deze cyclus wordt herhaald tot de regio van belang of blok van weefsel is uitvoerig deelbaar. - De volgende stap is om uitvoerig hoofdstuk het blok van weefsel. Plaats een kleine hoeveelheid van de inbedding medium op de boorkop en laat het bevriezen. Plaats de boorkop in de microtoom hoofd en genoeg afscheren van de bevroren medium op een vlakke ondergrond te hebben. Haal de boorkop uit de microtoom hoofd en plaats vlak binnen de cryostaat. Giet inbedding medium op de boorkop en stevig in de hersenen blokkeren plaats met de gesneden kant stereotaxically vlak gepositioneerd op de boorkop. Langzaam en volledig insluiten van de hersenen bij het monteren van medium. Plaats de boorkop met de hersenen in de microtoom hoofd en deel met behulp van de vooraf bepaalde parameters voor de sectie sampling frequentie.
- Zodra het blok van weefsel is uitgebreid coupes en secties worden geplaatst in putten, bedek de plaat met het deksel, wikkel de deksel met parafilm, en plaats in een -20 ° C vriezer. Log het totale aantal secties die voor elke serie, de sectie-sampling interval, en het aantal reeksen voor elk dier. Dit logboek zal van vitaal belang om bij te houden van latere verwijdering van delen van de hersenen bank voor de toekomst immunohistochemie.
Deel 4: representatieve resultaten:
Systematische bemonstering op deze manier is een gangbare praktijk in ons laboratorium in de afgelopen 3 jaar. We hebben een veel succes uitvoeren van immunohistochemie op materiaal dat is opgeslagen in het antigeen te behouden drie jaar nadat het werd gesneden, zonder verslechtering van het signaal (Figuur 1). Bovendien, als onderdeel van onze hersenen bank hebben we ingelogd bijna 20.000 systematisch delen van de niet-menselijkeprimaat hersenen (figuur 2) als onderdeel van onze lange-termijn onderzoek plannen. 
Figuur 1. Dit is een gedeelte van de occipitale pool van de niet-menselijke primaat immunostained voor Neun laten zien zowel laag VI en interstitiële witte stof neuronen. Deze bijzondere sectie werd opgeslagen in het antigeen te bewaren bij -20 ° C voor een periode van 2 jaar. Schaalbalk = 100 urn. 
Figuur 2. Onze vervet hersenen bank bestaat nu uit bijna 20.000 systematische secties van meer dan 30 apen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Systematische steekproef is een goedkope methode bedoeld om onderzoeksmateriaal te maximaliseren. Deze bemonstering strategie is ontworpen om te voldoen aan de regels van onpartijdige stereology dat systematische bemonstering in de hele regio nodig heeft. Het is cruciaal dat de volgorde van de secties voor elke serie wordt gehandhaafd. In ons laboratorium hebben we met succes gebruik gemaakt van deze methode voor banken zowel de hamster en niet-menselijke primaat hersenen secties. Tot nu toe hebben we verzameld bijna 20.000 vervet aap (Chlorocebus aethiops sabeus) de hersenen secties en routinematig immunohistochemisty uit te voeren op secties die zijn opgeslagen voor meer dan een jaar. De voordelen van een goed gekarakteriseerde hersenen bank omvatten de mogelijkheid om gegevens te verzamelen tussen financieringsbeslissingen, mogelijkheid voor nieuwe studenten om snel gegevens te verzamelen, en het minimaliseren van het gebruik en de behandeling van nieuwe dieren, waardoor het maximaliseren van de middelen voor onderzoek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
De auteurs willen graag Ikiel Ptito bedanken voor zijn voortdurende technische ondersteuning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethylene glycol | Fisher Scientific | E178-4 | |
| Polyvinyl pyrrolidone | Fisher Scientific | BP431-500 | |
| Thermal Scientific Embedding Medium | Fisher Scientific |
References
- West, M., Slomianka, L., Gundersen, H. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. Aat Rec. 231, 482-497 (1991).
- Burke, M. W., Zangenehpour, S., Boire, D., Ptito, M. Dissecting the Non-human Primate Brain in Stereotaxic Space. J Vis Exp. , (2009).
