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Biology

Cervello Banking: Utilizzare al meglio il vostro campioni di ricerca

doi: 10.3791/1260 Published: July 24, 2009

Summary

Banche del cervello e campionatura sistematica di materiale biologico costituisce la base per stereologia imparziale e massimizza il potenziale dei dati ottenuti da ogni campione.

Abstract

Tutti stereologia è un metodo per precisione ed efficienza stimare il numero totale dei neuroni (o tipo di cellula) in una data area di interesse

Protocol

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Parte 1: Pre-trattamento dei tessuti

  1. Tessuto deve essere ben perfusi con paraformaldeide, glutaraldeide, o formalina. Questo può essere raggiunto attraverso standard di perfusione transcardial tipicamente usato per raccogliere altri organi. Nel presente studio il soggetto era profondamente sedato con cloridrato di ketamina (10 mg / kg, im), eutanasia con una dose eccessiva di sodio pentobarbital (25 mg / kg, iv) e perfusi transcardially con 0,1 M PBS fino a completo dissanguato. Questa è seguita da una soluzione di paraformaldeide al 4% in PBS per 5 min (~ 1 litro).
  2. Il cervello deve essere stereotaxically bloccato, rimosso dal cranio, pesato, e il volume determinato 2. Il tessuto deve quindi essere crioprotetti in soluzioni di saccarosio classificato con una concentrazione finale di 30% di saccarosio in tampone fosfato. Blocchi di tessuto deve essere congelato in isopentano a -65 ° C e conservati a -80 ° C fino a quando si è pronti a fetta.

Parte 2: campionamento sistematico

  1. Campionamento sistematico si basa su un piano adeguato prima di sezionamento. L'intera regione di interesse in entrambe le estensioni rostrale-caudale e dorso-ventrale deve essere ben definito. Un atlante stereotassico delle specie in uso è utile per definire la regione di interesse e per determinare la lunghezza della regione di interesse. Una volta che la lunghezza della regione di interesse è determinato, è necessario stabilire l'intervallo di campionamento. Per esempio, dal atlante stereotassico si stabilisce che l'intero rostro-caudale estensione della regione di interesse è di circa tre millimetri di lunghezza Durante il taglio nel piano coronale. Quindi decide di impostare il criostato alla sezione a 50 micron, di questo passo si avrà 60 sezioni che coprono il rostrale-caudale estensione della regione di interesse. Per un tipico studio imparziale stereological 6-10 sezioni sistematicamente campioni sono necessari per ottenere risultati attendibili. In questo esempio 10 sezioni equidistanti in tutto il rostro-caudale risultato misura in un intervallo di campionamento di 1 / 6 sezioni.

Parte 3: Creazione della banca del cervello

  1. Una volta che la frequenza di campionamento sezione è stato determinato, il passo successivo è quello di determinare che le macchie verrà eseguita immediatamente. Per esempio, se siete colorazione con violetto cresolo potrete catturare 1 / 6 sezioni su una diapositiva. Questo sarà serie 1. Se sai che forse diversi anticorpi potenziale che si desidera eseguire, ma entrambi vogliono vedere i dati che fornisce il vostro principale macchia o semplicemente non hanno il tempo per eseguire l'immunoistochimica, posto il restante 5 serie di sezioni nell'ordine in cui sono sono stati tagliati a preservare pozzetti contenenti antigeni (1 pirrolidone polivinile%, glicole etilenico al 50% in o.1M PBS, pH 7,4). La seguente tabella fornisce uno schema di campionamento composto da 1 scivolo e 1 piastra (standard piastra da 48 pozzetti) di sezioni come parte di una banca del cervello (Tabella 1).
    Tabella 1
    Tabella 1. La frequenza di campionamento sezione qui è 1 / 6. La prima sezione è posto su un vetrino per la colorazione violetto cresolo e il prossimo 5 sezioni sono poste in antigene preservare. Numero della sezione 7 è poi catturato sulla diapositiva e le sezioni 9-12 sono collocati in antigene preservare. Questo ciclo viene ripetuto fino a quando la regione di interesse o il blocco dei tessuti è esaustivo sezionato.
  2. Il passo successivo è quello di sezione esaurientemente il blocco di tessuto. Mettere una piccola quantità di incorporare medio sul mandrino e farlo congelare. Posizionare il mandrino nella testa microtomo e radere abbastanza del mezzo congelato di avere una superficie piana. Rimuovere il mandrino dalla testa microtomo e luogo pianeggiante all'interno del criostato. Versare incorporare medio sul mandrino e saldamente posto il blocco cervello con il lato stereotaxically taglio posizionato categoricamente sul mandrino. Incorporare lentamente e completamente il cervello in montaggio di media. Posizionare il mandrino con il cervello nella testa microtomo e la sezione con il pre-determinati parametri per la frequenza di campionamento sezione.
  3. Una volta che il blocco di tessuto è stata esaurientemente sezionato e le sezioni sono collocati in pozzi, coprire la piastra con il coperchio, avvolgere il coperchio con parafilm, e mettere in un congelatore di -20 ° C. Registro il numero totale delle sezioni adottate per ciascuna serie, la sezione-intervallo di campionamento, e il numero di serie per ogni animale. Questo registro sarà vitale per tenere traccia di successiva rimozione di sezioni dalla banca cervello per immunoistochimica futuro.

Parte 4: Risultati Rappresentante:

Campionamento sistematico in questo modo è stata una pratica standard nel nostro laboratorio negli ultimi 3 anni. Abbiamo avuto un grande successo di immunoistochimica eseguire sul materiale che è stata conservata in antigene preservare tre anni dopo è stato tagliato senza deterioramento del segnale (Figura 1). Inoltre, come parte della nostra banca cervello che abbiamo registrato vicino a 20.000 sezioni sistematica della non-umanocervello dei primati (Figura 2) come parte della nostra piani a lungo termine della ricerca.

Figura 1. Questa è una sezione dal polo occipitale del primate non umano immunostained per NeuN mostrando sia VI livello e interstiziale neuroni della sostanza bianca. Questa particolare sezione è stato immagazzinato in antigene conservare a -20 ° C per un periodo di 2 anni. Barra di scala = 100μm.

Figura 2
Figura 2. La nostra banca cervello cercopiteco ora è composta di quasi 20.000 sezioni sistematico da oltre 30 scimmie.

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Discussion

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Campionamento sistematico è un metodo poco costoso scopo di massimizzare il materiale di ricerca. Questa strategia di campionamento è stato progettato per rispettare le regole di stereologia imparziale che richiede il campionamento sistematico in tutta la regione. E 'fondamentale che l'ordine delle sezioni per ogni serie è mantenuta. Nel nostro laboratorio abbiamo utilizzato con successo questo metodo per il settore bancario sia criceto e non umani sezioni cervello dei primati. Finora abbiamo raccolto sezioni cervello vicino a 20.000 scimmia cercopiteco (Chlorocebus aethiops sabeus) ed eseguire di routine immunohistochemisty sulle sezioni che sono stati conservati per oltre un anno. I vantaggi di un ben caratterizzato banca cervello includono la possibilità di raccogliere dati tra decisioni di finanziamento, la capacità per i nuovi studenti di raccogliere velocemente i dati e minimizzare l'uso e il trattamento di nuovi animali in modo da massimizzare fondi per la ricerca.

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Acknowledgments

Gli autori desiderano ringraziare Ikiel Ptito per il suo continuo supporto tecnico.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ethylene glycol Fisher Scientific E178-4
Polyvinyl pyrrolidone Fisher Scientific BP431-500
Thermal Scientific Embedding Medium Fisher Scientific

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References

  1. West, M., Slomianka, L., Gundersen, H. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. Aat Rec. 231, 482-497 (1991).
  2. Burke, M. W., Zangenehpour, S., Boire, D., Ptito, M. Dissecting the Non-human Primate Brain in Stereotaxic Space. J Vis Exp. (2009).
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Burke, M. W., Zangenehpour, S., Ptito, M. Brain Banking: Making the Most of your Research Specimens. J. Vis. Exp. (29), e1260, doi:10.3791/1260 (2009).More

Burke, M. W., Zangenehpour, S., Ptito, M. Brain Banking: Making the Most of your Research Specimens. J. Vis. Exp. (29), e1260, doi:10.3791/1260 (2009).

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