Summary
Los primates no humanos es una importante especie de traslación para nuestra comprensión del desarrollo y el envejecimiento. La organización anatómica de la retina de primates pueden proporcionar información importante sobre las condiciones normales y patológicas en los seres humanos.
Abstract
El sistema visual en el ser humano se considera la puerta de entrada a todo el mundo y desempeña un papel principal en la gran cantidad de procesos sensoriales, perceptivos y cognitivos. Por lo tanto, no es sorprendente que la calidad de la visión está ligada a la calidad de vida. A pesar de la investigación clínica y básica general sobre las causas de los trastornos visuales, muchas formas de discapacidad visual, como la retinitis pigmentosa y la degeneración macular, la falta de tratamientos efectivos. Los primates no humanos tienen más características generales del desarrollo del ojo a la de los seres humanos. No sólo tienen una anatomía vascular similar, pero entre los otros mamíferos, los primates tienen la característica única de tener una región en la retina temporal especializados de alta agudeza visual, la fóvea
Protocol
Parte 1: Pre-procesamiento de tejidos
- Tejido debe ser buena perfusión con paraformaldehído, glutaraldehído, o formalina. Esto se puede lograr a través de la perfusión estándar transcardial normalmente se utiliza para la cosecha de otros órganos. Se recomienda que, poco después del sacrificio de los ojos se inyectan con un fijador justo debajo de la lente y se almacena en el fijador.
- En el presente estudio el tema fue profundamente sedado con clorhidrato de ketamina (10 mg / kg, im), sacrificados con una sobredosis de pentobarbital sódico (25 mg / kg, iv) y perfundidos transcardially con PBS 0,1 M hasta que esté completamente desangrado. Esto es seguido por una solución de paraformaldehído al 4% en PBS durante 5 minutos (aproximadamente 1 litro).
Parte 2: Extracción del globo ocular de la cavidad orbital
- Para facilitar el acceso al globo ocular, se recomienda retirar primero el cerebro. Una vez que el cerebro se ha quitado el hueso órbita de paredes delgadas es evidente. Utilice la gubia ósea para chips lentamente la pared de la órbita. Cortar los músculos oculares con un bisturí y extirpar el tejido conectivo del globo ocular. Corte cuidadosamente el nervio óptico, esto puede ser utilizado en los estudios de microscopía electrónica. El globo del ojo ya debería ser liberado de la cavidad orbital.
Parte 3: Disección de la retina de la ojera
- Coloque el ojo en una placa de Petri con PBS para mantener la retina de secado. Un microscopio de disección o una mesa montada aumento de pie de luz es muy útil en la disección, pero no una necesidad. Retire la córnea mediante la reducción de la esclerótica de cerca en el perímetro de la córnea a nivel de la ora serrata, con un par de tijeras de primavera y quitar la lente con la pinza.
- Use un pincel, pinzas y tijeras de primavera para eliminar la retina de la esclerótica. Esto se hace mediante la separación de la retina de la esclerótica y luego cortar la esclerótica de distancia con las tijeras. Uno debe llevar a cabo este proceso en pequeños incrementos para no dañar o romper el tejido de la retina. La esclerótica no se separa fácilmente del nervio óptico remanente para cortar cuidadosamente la esclerótica alrededor del nervio óptico.
- En este punto de la retina ha conservado su forma curva y tiene que ser aplastada para el muestreo. Antes del aplanamiento de la retina, el humor vítreo, que tiene la consistencia de la gelatina, se puede quitar en un bulto. Para aplanar la retina en una diapositiva, hacer varios cortes radiales con una hoja de bisturí. El humor vítreo residual ahora se puede quitar con papel de filtro ordinario y un pincel. La capa de células ganglionares de la retina se expone en este momento lo que es imprescindible que tenga cuidado al retirar el humor vítreo. Si el nervio óptico está todavía unido en el disco óptico, quite el nervio óptico sin necesidad de digitalizar la retina, utilizando un bisturí y un par de tijeras de primavera. Esta es ahora una retina plana de montaje (Figura 1) y la fóvea debe ser evidente que una mancha oscura en la dirección temporal / ventral de la papila óptica.
Parte 4: Muestreo
- Hay una serie de opciones para el muestreo de la retina. Aquí vamos a describir la preparación y toma de muestras flatmount isodentric. En ambos procedimientos flatmount la retina con la capa de fibra óptica fuera de la diapositiva. Si la intención es examinar la capa de células ganglionares de la retina en la preparación flatmount, es necesario quitar uno o blanquear el epitelio pigmentado. Para quitar el epitelio pigmentado utilizar un pincel ligeramente para eliminar parte de esta capa, lo que tiende a dañar la capa de fotorreceptores. Blanqueo implica sumergir la retina en una solución de permanganato de potasio (0,25%) durante 1 hora, lavar en agua destilada, y la limpieza en ácido oxálico (5%) durante 5 minutos 2.
- Si la intención es analizar la distribución de células y la morfología de cada capa en toda la retina, entonces le sugerimos muestreo isométrica de la retina. La retina se debe flatmounted en un portaobjetos y se mantiene húmeda, con PBS. Para el muestreo isométrica cortar pequeños trozos de tejido equidistante de la papila óptica en las direcciones nasal, temporal, superior e inferior (Figura 1). No es necesario para blanquear el epitelio pigmentado en esta preparación. Estas piezas ahora se puede seccionar en el plano coronal con un criostato, vibratome o ultramicrotomo en función de la pregunta de investigación. Para la sección criostato, las piezas deben ser crioprotegieron en sacarosa al 30% durante la noche y se congeló en el contexto de un medio de montaje en hielo seco. Por otra parte, las muestras se pueden incrustar en agar y en rodajas en una vibratome. El criostato y preparaciones vibratome fiable dará secciones tan delgadas como 4 m. Si las secciones más finas son necesarias (por ejemplo, para la preparación del microscopio electrónico), es necesario preparar las muestras para el ultramicrotomo. Para ello, las secciones deben ser después de la fijada en tetróxido de osmio durante 1 hora bajo el fumehood. Esto es seguido por deshidratación en una serie gradual de etanol (50, 70, 95, 95, 100, 100%) y el 100% de óxido de propileno. El tejidose incrusta en Epon (incrustar-812 Kit de incorporación).
Parte 5: Resultados del representante:
En nuestro laboratorio, que habitualmente realizan técnicas de inmunohistoquímica sobre retinas cryosectioned (Figura 2). En este caso estamos interesados en la isodensidades de los receptores cannabinoides (CB1) en la retina del primate. También examinamos los efectos de la exposición prenatal al alcohol en el sistema visual de los primates. Con este fin, estamos interesados en la densidad celular y el espesor de la capa en la fóvea y en la retina periférica. Para lograr esto, integrar las piezas de la retina en Epon, el tramo a 700 nm en un ultramicrotomo, y se tiñen con azul de toluidina al 1% (Figura 3).
Figura 1 Retina Flatmount. Cortes radiales se utilizan para aplanar la retina.
Figura 2 inmunotinción. Criosección de la retina periférica immunostained de CB1 en las células ganglionares de la retina están fuertemente marcadas con un etiquetado en las capas nucleares interna y externa. El espesor de esta sección es de 14 metros y se tiñeron en la diapositiva. RG - capa ganglionares de la retina; IP - capa plexiforme interna, IN - capa nuclear interna, OP - capa externa plexiforme; ON - la capa nuclear externa.
Figura 3 Fovea. Corte a través de la fóvea que se incrustó en Epon y en rodajas en una ultramicrotrome a 700 nm. La capa de fotorreceptores (PR) para alinear las secciones. Tenga en cuenta que toda la extensión de los fotorreceptores se pueden identificar lo que indica un ángulo adecuado en el plano coronal. Mediciones de densidad se tomaron a 300 m, 500 m, y 800 m del centro de la fosa foveal utilizando el sistema de imagen Bioquant.
RG - capa ganglionares de la retina; IP - capa plexiforme interna, IN - capa nuclear interna, OP - capa externa plexiforme; ON - la capa nuclear externa, barra de escala = 50 m
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La preparación de la retina como un wholemount permite el análisis de la topografía y la distribución espacial de cualquiera de la capa de células ganglionares y las células endoteliales de los vasos sanguíneos de la retina 3. La cuantificación de la densidad de las células en la periferia de la retina de los primates se logra fácilmente. Sin embargo, en las regiones perifoveal y foveal, el apilamiento de múltiples capas en la capa de células ganglionares obstruye la cuantificación. Para evitar este sesgo potencial, la fóvea y la región perifoveal puede ser diseccionada de la preparación wholemount, embebido en Epon, y se seccionaron en serie con un ultramicrótomo obtener semi-delgadas secciones en el plano coronal 2,4. Hay una serie de otras desventajas a la preparación wholemount, que se puede superar con paradigmas de muestreo alternativos.
La toma de muestras isométrica de la retina y el corte en el plano coronal ya sea en un criostato o vibratome permite un examen específico de las diferentes capas, que no puede realizarse fácilmente en una preparación wholemount. Seccionamiento de esta manera también permite la aplicación de protocolos múltiples immnohistochemistry 5. Estas secciones se puede retirar de la diapositiva, embebido en Epon y en rodajas en una ultramicrotomo. Con cambios de menor importancia en ultramicrotomo el ángulo de corte se puede hacer para asegurar un plano coronal estándar a través de los fotorreceptores. Una vez que un avión estándar se ha obtenido, espesor de la capa puede ser medido y comparado entre las regiones de la retina y los sujetos. Por otra parte, Epon tejido incorporado puede utilizarse en estudios de microscopía electrónica para revelar características ultraestructurales de la retina 6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a Ikiel Ptito por su apoyo técnico. Estamos muy agradecidos a Frank Ervin, Palmour Roberta y el personal de Laboratorios de Ciencias del Comportamiento fundación con sede en San Cristóbal, de las Indias Occidentales, por su continuo apoyo a nuestro trabajo de primates.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Scalpel | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15020-15 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | Any surgical scissors are sufficient |
| Rongeurs | Fine Science Tools | 16121-14 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Filter paper | Fisher Scientific | 09-924-150 | |
| Camel or Sable Hair paintbrush | Any Supplier |
References
- Hendrickson, A., Kupfer, C. The histogenesis of the fovea in the macaque monkey. Invest Ophthalmol Vis Sci. 15, 746-756 (1976).
- Herbin, M., Boire, D., Ptito, M. Size and distribution of retinal ganglion cells in the St. Kitts green monkey (Cercopithecus aethiops sabeus). J Comp Neurol. 383, 459-472 (1997).
- Stone, J. The Wholemount Handbook. , Maitland Publishing Pty. Ltd. Sydney. (1981).
- Herbin, M., Boire, D., Theoret, H., Ptito, M. Transneuronal degeneration of retinal ganglion cells in early hemispherectomized monkeys. Neuroreport. 10, 1447-1452 (1999).
- Krebs, W., Krebs, I. Primate Retina and Choroid Atlas of Fine Structure in Man and Monkey. , Springer-Verlag. New York. (1991).
- Pow, D., Sullivan, R. Nuclear kinesis, neurite sprouting and abnormal axonal projections of cone photoreceptors in the aged and AMD-afflicted human retina. Exp Eye Res. 84, 850-857 (2007).
