Summary
영장류 두뇌의 해부 학적 조직은 인간의 정상 및 병리 학적 조건에 중요한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 불편 stereology 정확하고 효율적으로 주어진 참조 공간에 총 뉴런 번호 (또는 다른 세포 유형) 계산하는 방법입니다
Abstract
비 인간 영장류는 인간 두뇌의 정상적인 기능과 질병 프로세스를 이해하는 중요한 translational 수종입니다. 불편 stereology, 조직 섹션에 생물 학적 개체의 부량을위한 최첨단으로 인정하는 방법
Protocol
1 부 : 조직의 사전 처리 버크 외에 따라 수행되어야합니다. (2009) 5.
- 간단히, 조직이 잘 paraformaldehyde, 글루 타 알데히드, 또는 포르말린과 perfused해야합니다. 이것은 일반적으로 다른 장기를 수확하는 데 사용되는 표준 transcardial 재관류를 통해 달성될 수있다. 현재 연구에서 주제가 깊이 나트륨 pentobarbital (25 MG / kg, IV)의 과다로 euthanized 케타민을 하이드로 클로라이드 (10 MG / kg, IM)과 진정했고 완전히 exsanguinated 때까지 0.1 M PBS로 transcardially perfused. 이것은 5 분 (~ 1리터)을 PBS에 4 % paraformaldehyde 솔루션옵니다. 조직은 잘 paraformaldeyhde, 글루 테르 알데히드 또는 포르말린과 perfused해야합니다. 두뇌가 stereotaxically, 차단 두개골에서 제거, 무게되어야, 볼륨 결정 cryoprotected, 5 냉동.
2 부 : 조직의 체계적인 샘플링, 버크 외했다. (2009) 6.
- 이 예제에서 우리는 vervet 두뇌의 전두엽에 초점을 맞추었습니다. 참조 공간은 중앙 고랑에서 왼쪽 북반구의 전두엽 극으로 대뇌 피질의 조직을 포함하도록 정의되었다. 우리의 목적을 위해 시리즈는 50μm에서 sectioned 피질 전반에 걸쳐 10분의 1 섹션에서 설정되었다. 하나의 완전한 시리즈는 cresyl 바이올렛 (시리즈 # 1)와 스테인드했습니다. 섹션의 절반 myelin의 계시와 아세틸콜린의 esterase에 대한 다른 반쪽의 스테인드 (특정 subcortical 지역의 묘사)을위한 황금 염화 물들일 너무나 시리즈 2 분할되었다. 다른 모든 시리즈는 우리의 장기적인 연구 계획의 일환으로 항원 보존에 틀었되었습니다.
파트 3 : Stereology (자세한 내용은, 무통 2002 참조) 4
- 세포 숫자의 총 평가 (N)은 다음 방정식에 따라 계산됩니다 :
N = ssf -1 X ASF -1 X tsf -1 X Σ Q -
계산의 관심 개체의 총 수입니다 - 두께 샘플링 분율 (조직의 측정 두께가 해부학자 높이로 나눈 어디에), 그리고 Σ Q는 경우 ssf의 시작 부분 샘플링 분수는 어디, ASF는 지역 샘플링 분수, tsf입니다 해부학자 이내. 이 프로토콜의 다음 섹션 ssf, ASF, tsf과 Σ Q를 결정하는 방법을 보여줍니다. - 섹션 샘플링 분율 (비 컴퓨터 기준)
- 전체 참조 공간은 잘 복부에 사후에 앞쪽에와 지느러미에서 정의해야합니다. 이 예제에서 우리는 전두엽에 관심이 있었는데 전두엽 극 (앞쪽에)의 끝에서 중앙 고랑 (후부)과 측면 고랑 (복부)에 지역으로 정의하고 인슐라을 제외했습니다.
- 이 특정 주제의 전두엽에 대한 760 섹션의 총 체계적으로 cresyl 바이올렛 76 스테인드 함께 수집했다. 대상은 참조 공간에 걸쳐 10 섹션 이후 육분의 일 cresyl 바이올렛 스테인드 섹션 1 / 60의 섹션 샘플 분수로 이어지는, 샘플링했다. 우리는 무작위로 첫번째 6 cresyl 보라색 스테인드 섹션 중 하나를 시작하여 체계적으로 이후 육분의 일 중에서도. 13 섹션의 총 선택 제목 (그림 2) 샘플되었습니다.
지역 샘플 분율 (컴퓨터 기준)- 파일럿 연구는 약 100-300 disectors로 참조 공간을 샘플로, 최적의 그리드 크기, 지역 샘플링 분수를 나타냅니다. 전두엽 내에서, 2500 μm의 2 격자 크기는이 주제에 대한 254 disectors (그림 2)의 평균이 나왔고. disector의 크기는이 경우에는 0-5 집계 개체, 뉴런에 대한 사이를 얻을 것입니다.
- 두께 샘플 분율 (컴퓨터 기준)
- 각 disector 위치에서 조직의 높이가 측정되며,이 높이의 분수는 샘플이며 이것은 두께 샘플링 분수로 알려져 있습니다. 마지막으로 개체가 초점 그냥 나타날 때까지 첫 번째 세포가 다시 약간 섹션, 즉 상단에 다음 초점에 와서까지 측정된 두께를 확인하려면 Z - 비행기를 통해 중점을두고 있습니다. 세포가 초점 거의 때까지 조직의 바닥을 확인하려면, Z - 비행기를 통해 중점을두고 있습니다.
- Z - 비행기를 통해 초점, 세포마다 깊이에 물들다해야한다하지 않을 경우,이 섹션이 다시 묻은되어야하는 경우, 조직의 얼룩이나 비 균일한 탈수의 불완전 침투를 나타낼 수 있습니다. 이주의는 비교적 두꺼운 조직 섹션을 통해 immunoprobes의 침투력을 필요로 immunostained 조직에 특히 중요합니다. 이러한 이유로, immunostained 조직은 가볍게 basophilic 얼룩 (예 : cresyl 바이올렛, hema와 counterstained해야toxylin) 순서로 정확하게 섹션의 상단과 하단을 확인하고 항체의 침투를 확인합니다. 본 연구에서는 섹션은 50μm의 마이크로톰 설정에 얇게했다. 모든 조직 처리가 완료된 후, 측정된 조직의 두께는 65 % 정도의 의미 수축과 17.9μm (그림 2) 평균. 이러한 결과는 일상 histological 준비 7에 대한 처리 조직에 대한 일반적인 수축을 대표합니다.
- 전형적인 연구에 대한 기본 disector 높이가 10μm이다. disector 높이와 측정 부분의 두께 사이의 차이점은 경비의 높이, 더 생물 학적 기능이 계산되지 않습니다 조직의 볼륨입니다. 가드 높이의 사용 (예, 분실 모자) sectioning 표면에서 조직 손상을 방지합니다.
- 개체의 총 수입은 계산, Σ Q -
- 인식 오류에서 편견을 피하기 위해, 그것은 표준 정의가 관심의 특정 생물 학적 기능에 따라입니다 필수적입니다. 이 경우, 우리는 뉴런을 계산에 관심이 있었다. 따라서 신경 세포는 glial 세포가 일반적으로 볼 수 nucleoli와 세포질이 부족해 반면, 보이는 중앙에 위치한 nucleolus하고 명확하게 정의된 세포질을 가진 것으로 정의했다. 이 주제에 457 뉴런은 계산 하였다.
4 부 : Stereologer - 전산 Stereology 시스템 (Stereology 리소스 센터, 체스터, MD)
- Stereologer 시스템은 사용자가 단계별로 패션에 필요한 정보를 기입하라는 메시지가 나타납니다. "유학 정보 '섹션에서 연구의 매개 변수가 설정됩니다. 참조 공간이 연구에 대해 정의해야하므로, 볼륨 매개 변수 (참조 공간 Cavalieri 견적 도구 (Traffic Estimator)를 선택한다)을 선택합니다. 개체 볼륨도 관심 객체의 인구의 번호 - 가중치 볼륨을 추정하려면 여기를 선택할 수 있습니다. 우리의 예를 들어, 참조 공간만을 볼륨이 선택되었습니다. 각 개체에 대해 번호를 선택하고이 경우 뉴런에 대한 관심의 기능을 정의합니다.
- 사례 초기화 :이 섹션에서는 샘플링 정보가 설정됩니다. 슬래브 샘플링 간격 (조직 별도의 슬라브는 철저하게 슬라이스되었으며 각 섹션이 순차적으로 배치하는 경우에는 다음 여기에 1을 입력)를 입력합니다. 참조 공간 (760이 경우)를 통해 촬영한 섹션의 총 수를 입력합니다. 다음 섹션 샘플링 간격 (이 경우 59)을 입력합니다. 시스템이 (이 경우 13) 샘플 수 섹션의 수를 계산합니다.
- 프로브 매개 변수 :이 섹션은 그리드와 disector 크기를 정의합니다. 볼륨의 경우 편집 메뉴에서 격자 간격을 정의하기 위해 2.5x - 10X 낮은 배율을 사용합니다. 개체 배율은 100x (NA 1.3 1.4)에서 수행되어야합니다. 프레임 영역은 disector의 크기이 경우에 우리는 50 % 화면을 사용. 프레임 높이 disector의 두께이며 여기 10μm에서 설정할 수 있습니다. 프레임 간격은 격자의 크기입니다. 우리의 파일럿 연구에서 우리는 150-200 프레임 사이 2500μm 수확량은 비교적 큰 레퍼런스 공간을 통해 체계 - 균일한 방식으로 간격 것으로 나타났습니다. 작은 영역에 대한, 작은 격자 크기를 사용해야합니다. 파일럿 연구는 각 특정 연구에 대한 광학 프로브 매개 변수를 식별합니다.
- 일단 공부 매개 변수가 설립되어, 조직을 통해 샘플링하면 계속 진행됩니다. 프로그램은 첫 번째 섹션을 예제하라는 메시지가 나타납니다 1 단계 :. 프로그램 섹션에서 참조 공간을 추적하기 위해 낮은 배율에서 사용자에게 메시지가 표시됩니다. 시스템이 해당 지점이 참조 공간 내에서 가을에 확인됩니다 프로브 매개 변수와 사용자에 따라 섹션을 통해 그리드를 배치합니다. 지점이 참조 공간 내에서하지 않으면 단순히 지점을 클릭하고 볼륨으로 계산되지 않습니다 2 단계 :. 시스템이 프레임 간격 매개 변수에 따라 참조 공간을 통해 새로운 그리드를 배치합니다. 확인하는 교차로는 참조 공간 내에서 가을 3 단계 :. 시스템이 다음 사용자가 더 높은 배율의 목표로 전환하고 첫 번째 해부학자로 무대를 이동하라는 메시지가 나타납니다 4 단계 :.이 시점에서 시스템은 사용자가 정의하라는 메시지가 나타납니다 . 상단과 섹션의 하단에 다음 시스템은 Z 축 5 단계에서 샘플링 공간을 설정 : 사용자가 다음 Z - 비행기를 통해 disector에 속하는 각 개체를 클릭합니다. 붉은 선 또는 disector의 땅에 닿으면 개체가 계산되지 않을 수 있습니다. 각 개체가 계산되면 다음을 클릭합니다. 단계는 다음 disector과 4와 5를 반복한다 단계로 이동합니다. 일단 섹션의 disectors의 모든 시스템이 탐지하는 다음 순차 부분을 삽입하는 사용자에게 묻습니다, 계산되었습니다. 순차 섹션의 모든 때까지 단계 1-5을 반복합니다샘플되었습니다. 시스템이 ASF, ssf, tsf, 그리고 Σ Q에 대한 계산을 제공합니다. 이러한 매개 변수를 기반으로, 시스템은, 참조 볼륨을 예상 N을 생성하고 CE의 예상 번호와 볼륨 모두 것입니다. 또한보다 효율적으로되기 위해 권장 사항을 제공합니다 또는 CE (그림 2)을 줄일 수 있습니다.
제 5 부 : 대표 결과 :
불편 stereology는 참조 공간 내에서 세포 인구의 효율적이고 신뢰할 수있는 견적을 제공합니다. 체계적 표본 추출 및 정의 참조 공간에 의존하는 모든 가능한 컴퓨터 기반 stereological 시스템의 여러 가지가 있습니다. 우리는 0.042의 평균 CE와 함께 828 백만 (그림 3) 이상으로 2 년 된 vervets의 대뇌 피질의 전체 인구의 연결을 예측할 수있는 BioQuant 생명 과학 시스템을 사용하고 있습니다. 우리는 이후 추정에 Stereologer 시스템을 사용한 대뇌 피질의 뉴런의 절반에 대한 숫자 8에 대한 전두엽 계정 것을.
그림 1 컴퓨터 기반 Stereology 시스템. stereology 시스템의 기본 셋업은 전동 무대 (XYZ)와 같은 현미경, 무대 컨트롤러, 비디오 카메라, 컴퓨터 및 소프트웨어입니다. 궁극적으로 선택되는 시스템은 효율성, 요구 사항 및 비용 분석에 기초해야합니다.
| 연구 정보 | |
| 스터디 이름 | 전두엽 피질 |
| 교장 인베스티게이터 | 메가바이트 |
| 종 | AG |
| 참조 스페이스 정면 | 피질 |
| 노트 | |
| 사례 정보 | |
| 데이터 수집기 | 메가바이트 |
| 날짜 | 수요일, 2008 년 4월 30일 |
| 그룹 | 제어 |
| 제목 | O26 |
| 노트 | |
| 샘플링 특성 | |
| 슬래브 샘플링 간격 | 1 |
| 섹션의 총 수 | 760 |
| 섹션 샘플링 간격 | 59 |
| 시작 섹션 | 2 |
| 분수 | |
| ASF | 0.0002 |
| SlabSF | 1.0000 |
| SSF | 0.0169 |
| TSF | 0.5587 |
| 결과 요약 | |||||
| 매개 변수 | 탐침 | 이름 | 결과 | CE | SD |
| 두께 | --- | --- | 17.8996 μ | --- | --- |
| 번호 | Disector | 신경 세포 | 243833769.1473 | 0.0474 | N / A |
| 음량 | Cavalieri 포인트 그리드 | 음량 | 1719769397954.1284 μ ^ 3 | 0.0078 | N / A |
| 추천 | |
| 탐침 | 개체 번호 (뉴런) |
| CE | 0.0474 |
| 추천 | CE이 허용됩니다. |
| 조회 Disectors의 숫자가 너무 높은, Disector 간격을 늘립니다. | |
| 탐침 | 지역 볼륨 (볼륨) |
| CE | 0.0078 |
| 추천 | CE이 허용됩니다. |
| 제 결과 | ||
| 섹션 | 신경 세포는 신경 세포 NumCorners을 NumObjects | 볼륨 RegPoints |
| 1. 40 | 48 | 34 |
| 2. 26 | 52 | 44 |
| 3. 29 | 56 | 48 |
| 4. 39 | 100 | 83 |
| 5. 49 | 112 | 83 |
| 6. 53 | 156 | 120 |
| 7. 65 | 128 | 106 |
| 8. 45 | 108 | 100 |
| 9. 52 | 100 | 77 |
| 10. 26 | 64 | 60 |
| 11. 21 | 44 | 44 |
| 12. 11 | 36 | 32 |
| 13. 1 | 12 | 6 |
Stereologer 시스템과 획득 Fontal 로브에서 2 결과를 그림. 전두엽은 stereological 프로세스의 가장 긴 부분은 체계적인 샘플링과 sectioning에. 지형, 음량의 연결 견적은 각 주제에 대해 약 하루에 완료했다. 왼쪽 반구는 샘플되었고 숫자는 두 반구에 대한 대략적인 견적으로 텍스트에 두 배가됩니다.
그림 3의 연결 접속 인구 견적 BioQuant와 취득. BioQuant 시스템이 전에 셀 카운팅에 정확한 지형이 필요합니다. 여기에 13 섹션의 평균 샘플링했다. 대뇌 피질의 지형 및 후속 볼륨 평가는 각 과목에 대한 15-20시간 사이했습니다. 지형은 2.5x 목적하에 수행되었으며 계산은 100x 기름 침지 목표 (NA 1.3)를 사용하여 이루어졌다. 모든 100번째 섹션 샘플 180 disectors의 평균과 왼쪽 반구 전체에 선정되었습니다. 지형이 완성되면 계산의 연결은 하루 정도 걸렸죠. 왼쪽 반구는 샘플되었고 숫자는 두 반구에 대한 대략적인 견적으로 텍스트에 두 배가됩니다.
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Discussion
영장류 두뇌에 불편 stereology 다른 생물 학적 표본의 비슷합니다. 50μm에서 슬라이스 때 vervet 원숭이의 단일 반구 이상 1,200 섹션을 산출 이래 그러나 영장류 두뇌의 크기에 따라,주의 처리 계획을 권장합니다. 먼저 우리는 stereotaxically, 블록과 과목 사이의 섹션의 표준 평면을 제공 블록 사이의 부분 부분을 최소화하고, 관리 크기의 블록 5를 제공 1cm 단위로 머리를 차단하는 것이 좋습니다. stereology을위한 중요한 단계는 6-10 섹션 참조 영역을 통해 얻을 수있다 그러한 체계적으로 샘플링됩니다. 영장류 두뇌 들어, 우리가 장기 연구 계획 6 보존 항원의 조직을 제안 은행 각 뇌에서 얻은 데이터의 가능성을 극대화하기 위해, 그래서 처리되지 않은 물질의 상당한 금액을 떠납니다. 조직 은행에 차압 당했고되면, 원숭이 두뇌의 대상 단백질을 확인하는 체계적인 면역 접근은 stereology 9 준비하실 수 있습니다. 등 피질이나 엽 (叶)과 같은 큰 지역 있도록 사전 계획이 잠재적인 관심의 작은 공간 참조를 통해 적어도 10 섹션을 가지고 이루어져야 sectioning로, 10-14 섹션을 요구할 수 있습니다. 파일럿 연구도 stereological 연구에 대한 매개 변수를 설정하는 제어 대상에서 수행되어야합니다. 또한 게시된 stereological 데이터를 제시하거나 해석하는 것은 ASF, tsf, ssf, 그리고 Σ Q는 적절한 CE 값과 함께보고하여야한다.
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Acknowledgments
저자는 자신의 지속적인 기술 지원 Ikiel Ptito 감사하고 싶습니다. MP에 NSERC 부여합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereologer | Stereology Resource Center (Chester, MD) | www.disector.com | |
| Stereology Tool-Kit Stereologer system | BioQuant Life Sciences (Nashville, TN) | ||
| StereoInvestigator | MBF Bioscience |
References
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- Saper, C. B. Any way you cut it: a new journal policy for the use of unbiased counting methods. J Comp Neurol. 364, 5-5 (1996).
- Sterio, D. C. The unbiased estimation of number and sizes of arbitrary particles using the disector. J Microsc. 134, 127-136 (1984).
- Mouton, P. R. Principles and Practices of Unbiased Stereology. , The Johns Hopkins University Press. Baltimore. (2002).
- Burke, M. W., Zangenehpour, S., Boire, D., Ptito, M. Dissecting the non-human primate brain in stereotaxic space. J Vis Exp. 29, (2009).
- Burke, M. W., Zangenehpour, S., Boire, D., Ptito, M. Brain banking: Making the most of your research. J Vis Exp. 29, (2009).
- Manaye, K. F., Wang, P., O'Neil, J., Huafu, S., Tizabi, Y., Thompson, N., Ottinger, M. A., Ingram, D. K., Mouton, P. R. Neuropathological Quantification Of Dtg APP/PS1: Neuroimaging, Stereology, And Biochemistry. AGE. 29, 87-96 (2009).
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- Zangenehpour, S., Burke, M. W., Chaudhuri, A., Ptito, M. Batch immunostaining for large-scale protein detection in the whole monkey brain. J Vis Exp. 29, (2009).
