Summary
La organización anatómica del cerebro de los primates puede proporcionar información importante sobre las condiciones normales y patológicas en los seres humanos. Estereología imparcial es un método de forma precisa y eficiente la estimación del número de neuronas total (o otro tipo de células) en un espacio de referencia dado
Abstract
Los primates no humanos es una importante especie de traslación para entender los procesos normales de funcionamiento y las enfermedades del cerebro humano. Estereología imparcial, el método aceptado como estado de la técnica para la cuantificación de los objetos biológicos en secciones de tejido
Protocol
Parte 1: Pre-procesamiento de los tejidos se debe hacer de acuerdo con Burke et al. (2009) 5.
- En pocas palabras, el tejido debe estar bien perfundidos con paraformaldehido, glutaraldehido, o formalina. Esto se puede lograr a través de la perfusión estándar transcardial normalmente se utiliza para la cosecha de otros órganos. En el presente estudio el tema fue profundamente sedado con clorhidrato de ketamina (10 mg / kg, im), sacrificados con una sobredosis de pentobarbital sódico (25 mg / kg, iv) y perfundidos transcardially con PBS 0,1 M hasta que esté completamente desangrado. Esto es seguido por una solución de paraformaldehído al 4% en PBS durante 5 minutos (aproximadamente 1 litro). El tejido debe estar bien perfundidos con paraformaldeyhde, glutaraldehído, o formalina. El cerebro debe ser stereotaxically bloqueado, removido del cráneo, se pesa, volumen determinado, crioprotegieron y congelado 5.
Parte 2: Muestreo sistemático de tejido, de acuerdo con Burke et al. (2009) 6.
- En este ejemplo nos hemos centrado en el lóbulo frontal del cerebro, los monos verdes. El espacio de referencia se ha definido para incluir tejido cortical del surco central en el polo frontal del hemisferio izquierdo. Para nuestros propósitos, la serie se fija en 1 / 10 secciones a lo largo de la corteza, en secciones de 50 micras. Una serie completa se tiñó con violeta de cresilo (serie n º 1). Serie 2 se dividió de manera que la mitad de las secciones fueron teñidas con cloruro de oro para la revelación de la mielina y la otra mitad para el teñido de la acetilcolinesterasa (por la delimitación de ciertas áreas subcorticales). Todas las otras series fueron donados al banco de antígenos preservar como parte de nuestros planes de investigación a largo plazo.
Parte 3: Estereología (para más detalles, consulte Mouton 2002) 4
- La estimación total de número de células (N) se calcula con base en la siguiente ecuación:
N = ssf -1 x -1 x asf tsf -1 x Σ Q -
Ssf donde es la fracción de muestreo sección, asf es la fracción de muestreo por áreas, TSF, si la fracción de muestreo de espesor (en el que se mida su espesor del tejido se divide por la altura disector), y Q Σ - es el número total de objetos de interés contar en el disector. Las siguientes secciones de este protocolo se muestra cómo determinar el ssf, asf, TSF y Q Σ. - Sección fracción de muestreo (sin computadora)
- El espacio de referencia en su totalidad debe estar bien definido de anterior a posterior y dorsal a ventral. En este ejemplo estamos interesados en el lóbulo frontal y lo han definido como la región de la punta del polo frontal (anterior) con el surco (posterior) y el surco lateral (ventral) y se excluyó la ínsula.
- Para el lóbulo frontal de este tema en particular un total de 760 secciones se recogieron de forma sistemática con 76 teñidas con violeta de cresilo. Puesto que el objetivo era de 10 secciones en todo el espacio de referencia en las secciones 6.1 cresil violeta manchado en la muestra, dando lugar a una fracción de la muestra la sección de alrededor de 1 / 60. Aleatoriamente se inició con uno de los primeros seis secciones cresil violeta manchado y muestreos sistemáticos 01.06 en adelante. Un total de 13 secciones se tomaron muestras para el motivo seleccionado (Figura 2).
Área de fracción de la muestra (computer-based)- Un estudio piloto indica el tamaño de la malla óptima, la fracción de muestreo de Área, a la muestra el espacio de referencia con alrededor de 100-300 disectors. En el lóbulo frontal, una malla de 2500 m 2 se obtuvo un promedio de 254 disectors para este tema (Figura 2). El tamaño del disector debe producir entre alrededor de 0-5 objetos contados, en este caso, las neuronas.
- Espesor fracción de la muestra (computer-based)
- En cada lugar disector, la altura de los tejidos se mide, y una fracción de esta muestra es la altura, lo que se conoce como la fracción de muestreo de espesor. Para determinar el espesor medido, el enfoque a través del plano z hasta la primera celda se enfoca, de nuevo hacia arriba un poco a la parte superior de la sección, es decir, hasta el último objeto que aparece justo fuera de foco. Para determinar la parte inferior del tejido, el enfoque a través del plano z hasta que las células son poco fuera de foco.
- Centrándose por el plano z, las células deben teñirse en todas las profundidades, si no, esto puede indicar una penetración incompleta de la deshidratación mancha o no uniforme de los tejidos, en cuyo caso las secciones deben ser re-manchado. Esta precaución es especialmente importante para el tejido immunostained que requiere la penetración de immunoprobes a través de secciones de tejido relativamente grueso. Por esta razón, el tejido immunostained debe ser ligeramente counterstained con una mancha de basófilos (violeta, por ejemplo, cresilo, hematoxylin) con el fin de determinar con precisión la parte superior e inferior de la sección y para confirmar la penetración de los anticuerpos. En este estudio, las secciones fueron cortadas con un ajuste de microtomo de 50 micras. Después de todo el procesamiento del tejido se completa, el grosor del tejido mide un promedio de 17.9μm (Figura 2), con una contracción promedio de alrededor del 65%. Tenga en cuenta que estos resultados representan la contracción típica de los tejidos procesados para la preparación histológica de rutina 7.
- La altura del disector por defecto para el estudio típico es 10μm. La diferencia entre la altura del disector y el espesor de corte se mide la altura de guardia, el volumen de tejido en las características biológicas no son contados. El uso de una altura de guardia evita daños en los tejidos en las superficies de corte (por ejemplo, pérdida de tapas).
- El número total de objetos contados, Σ Q -
- Para evitar el sesgo de los errores de reconocimiento, es imperativo que una definición estándar es seguido por la particularidad biológica de interés. En este caso, estamos interesados en contar las neuronas. Por lo tanto, una neurona se define como tener un nucléolo visible situado en el centro y un citoplasma bien definido, mientras que las células gliales en general carecían de nucléolos visibles y el citoplasma. Para este tema 457 neuronas fueron contados.
Parte 4: Stereologer - Un sistema computarizado Estereología (Estereología Centro de Recursos, Chester, MD)
- El Sistema de Stereologer pide al usuario que rellene la información necesaria en una manera paso a paso. En el "Estudio de la información" sección de los parámetros del estudio se han establecido. Desde un espacio de referencia debe estar definido para el estudio, el parámetro de volumen deben ser seleccionados (para el espacio de referencia en el estimador de Cavalieri debe estar seleccionado). El volumen de objetos también pueden ser seleccionados desde aquí para calcular el número ponderado por el volumen de la población de objetos de interés. Para nuestro ejemplo, sólo el volumen del espacio de referencia seleccionado. Para cada objeto, seleccionar el número y definir la característica de interés, en este caso las neuronas.
- Inicialización caso: En esta sección la información de muestreo se ha establecido. Introduzca el intervalo de muestreo de la losa (si las losas separadas de tejido fueron cortadas de manera exhaustiva y cada sección se coloca en orden secuencial a continuación, introduzca una aquí). Escriba el número total de secciones tomadas a través del espacio de referencia (en este caso 760). A continuación, introduzca el intervalo de muestreo sección (en este caso 59). El sistema calcula el número de secciones que se muestra (en este caso 13).
- Los parámetros de la sonda: En esta sección se define la red y el tamaño del disector. Para el volumen, utilice un bajo aumento de 2.5x-10x para definir el espaciado de cuadrícula en el menú de edición. Ampliación del objeto debe realizarse a 100x (NA 1.3 o 1.4). Área de marco es el tamaño de la disector, en este caso se utilizó el 50% de la pantalla. La altura del marco es el espesor de la disector, fijado en 10μm aquí. La clara de cuadernas es el tamaño de la cuadrícula. En nuestro estudio piloto se encontró que los rendimientos de entre 150-200 2500μm marcos separados de una manera sistemática, uniforme a través de un espacio de referencia relativamente grande. Para áreas más pequeñas, un tamaño de malla más pequeña debe ser utilizado. Un estudio piloto identificará los parámetros de la sonda óptica para cada estudio en particular.
- Una vez que los parámetros del estudio se han establecido, a través de la toma de muestras de tejidos puede continuar. El programa le pedirá que muestra la primera sección. Paso 1: El programa le pedirá al usuario, con bajo aumento, para rastrear el espacio de referencia en la sección. Entonces, el sistema colocará una malla en la sección sobre la base de los parámetros de la sonda y el usuario se va a verificar que los puntos comprendidos en el espacio de referencia. Si un punto no se encuentra dentro del espacio de referencia, simplemente haga clic en el punto y no aparecen calculados en el volumen. Paso 2: El sistema coloca una nueva red en el espacio de referencia, en base a los parámetros de marco espacio. Verifique que las intersecciones están comprendidas en el espacio de referencia. Paso 3: El sistema le pedirá al usuario que cambie con el objetivo de aumento más alto y mover el escenario para el disector primero. Paso 4: En este punto, el sistema solicita al usuario definir el superior e inferior de la sección, entonces el sistema establece el espacio de muestreo en el Paso del eje z 5:. El usuario hará clic en cada objeto que cae en el disector por el plano z. Los objetos que tocan las líneas rojas o la parte inferior de la disector no podrán ser contados. Una vez que cada objeto se cuenta, haga clic en siguiente. El escenario se moverá a la siguiente disector y los pasos 4 y 5 se repetirá. Una vez que todos los disectors de la sección han sido contadas, el sistema le pedirá al usuario que inserte la sección siguiente secuencia que se probaron. Los pasos 1-5 se repite hasta que todas las secciones secuenciales tienenhan tomado muestras. Entonces, el sistema proporcionará a los cálculos de la ASF, SSF, TSF, y Q Σ. En base a estos parámetros, el sistema generará un estimado de N, el volumen de referencia y la CE, tanto para el número estimado y el volumen. También se dan recomendaciones para ser más eficientes o para reducir la CE (Figura 2).
Parte 5: Resultados del representante:
Estereología imparcial proporciona estimaciones eficientes y fiables de las poblaciones de células dentro de un espacio de referencia. Hay una serie de sistemas basados en computadoras estereológica disponibles, todos los cuales se basan en un muestreo sistemático y un espacio de referencia definidos. Hemos utilizado el sistema de vida Bioquant Ciencias para estimar el total de la población neuronal de la corteza cerebral de 2 años de edad, los monos verdes a más de 828 millones (Figura 3) con un promedio de 0,042 CE. Posteriormente hemos utilizado el sistema Stereologer para estimar que las cuentas del lóbulo frontal cerca de la mitad el número de neuronas corticales 8.
Figura 1 Los sistemas computarizados de Estereología. La configuración básica de los sistemas de estereología es lo mismo, un microscopio con una platina motorizada (xyz), un controlador de fase, una cámara de vídeo, ordenador y software. El sistema que finalmente se escogerán en función de la eficiencia, las necesidades y análisis de costos.
| ESTUDIO DE LA INFORMACIÓN | |
| Nombre del estudio | La corteza frontal |
| Investigador Principal | MB |
| Especies | AG |
| Referencia del espacio frontal | Corteza |
| Notas | |
| CASO DE INFORMACIÓN | |
| Recopiladores de datos | MB |
| Fecha | Miércoles, 30 de abril 2008 |
| Grupo | Control |
| Tema | O26 |
| Notas | |
| CARACTERÍSTICAS DE MUESTREO | |
| Intervalo de muestreo de la losa | 1 |
| Número total de las secciones | 760 |
| Sección Intervalo de Muestreo | 59 |
| Sección de partida | 2 |
| FRACCIONES | |
| ASF | 0,0002 |
| SlabSF | 1,0000 |
| SSF | 0,0169 |
| TSF | 0,5587 |
| RESUMEN DE LOS RESULTADOS | |||||
| Parámetro | Sonda | Nombre | Resultado | CE | SD |
| Espesor | --- | --- | 17.8996 μ | --- | --- |
| Número | Disector | neurona | 243833769.1473 | 0,0474 | N / A |
| Volumen | Cavalieri punto de la cuadrícula | volumen | 1719769397954.1284 μ ^ 3 | 0,0078 | N / A |
| RECOMENDACIONES | |
| Sonda | Número de objetos (las neuronas) |
| CE | 0,0474 |
| Recomendaciones | CE es aceptable. |
| Número de Disectors visto es muy alto, aumentar el espaciado Disector. | |
| Sonda | Región de volumen (volumen) |
| CE | 0,0078 |
| Recomendaciones | CE es aceptable. |
| RESULTADOS SECCIÓN | ||
| Sección | neurona NumObjects NumCorners neurona | RegPoints volumen |
| 1. 40 | 48 | 34 |
| 2. 26 | 52 | 44 |
| 3. 29 | 56 | 48 |
| 4. 39 | 100 | 83 |
| 5. 49 | 112 | 83 |
| 6. 53 | 156 | 120 |
| 7. 65 | 128 | 106 |
| 8. 45 | 108 | 100 |
| 9. 52 | 100 | 77 |
| 10. 26 | 64 | 60 |
| 11. 21 | 44 | 44 |
| 12. 11 | 36 | 32 |
| 13. 1 | 12 | 6 |
Figura 2 Resultados de la Lobe Fontal obtenidos con el sistema Stereologer. Para el lóbulo frontal, la parte más larga del proceso estereológica estaba en el muestreo sistemático y el corte. Estimación de la topografía, el volumen y neuronal se completa en aproximadamente un día por cada tema. El hemisferio izquierdo se muestra y el número se duplica en el texto de una estimación aproximada de los dos hemisferios.
Figura 3 Estimación de la corteza de la población neuronal obtenidos con Bioquant. El sistema Bioquant requiere una topografía exacta antes de que el recuento de células. Aquí un promedio de 13 secciones se tomaron muestras. Topografía cortical y la estimación del volumen posterior se entre 15-20 horas para cada tema. La topografía se realizó bajo un objetivo 2,5 x y el recuento se realizó con un objetivo de inmersión 100x (NA 1.3). Cada sección 100a fue elegido en todo el hemisferio izquierdo, con un promedio de 180 disectors la muestra. Una vez que la topografía se terminó de contar neuronal tomó cerca de un día. El hemisferio izquierdo se muestra y el número se duplica en el texto de una estimación aproximada de los dos hemisferios.
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Discussion
Estereología imparcial en un cerebro de los primates es similar a la de otras muestras biológicas. Sin embargo, dado el tamaño del cerebro de los primates, un plan de tratamiento cuidadoso, se recomienda desde un solo hemisferio de los monos verdes se obtienen más de 1200 secciones en rodajas a 50 micras. En primer lugar se recomienda stereotaxically bloqueando el cerebro en bloques de 1 cm, que proporciona un avión estándar de la sección entre los bloques y temas, minimiza las secciones parciales entre los bloques y bloques de tamaño manejable ofrece 5. Un paso crucial para estereología es un muestreo sistemático de tal manera que las secciones 6-10 se obtienen a través del área de referencia. Para el cerebro de los primates, lo que deja una cantidad importante de material sin procesar, por lo que con el fin de maximizar el potencial de los datos obtenidos de cada cerebro que sugieren la banca en el tejido antígeno preservar para los planes de investigación a largo plazo 6. Cuando el tejido se deposita, un enfoque sistemático para la identificación de inmunodetección proteínas diana en el cerebro del mono se puede preparar para estereología 9. Zonas más amplias como la corteza o lóbulos podrán solicitar 10-14 secciones, por lo que antes de seccionar un plan deberá contar con al menos 10 secciones a través del espacio más pequeño de interés de referencia potenciales. Un estudio piloto también se debe realizar en un sujeto de control para establecer los parámetros para el estudio estereológicos. Por otra parte en la presentación o la interpretación de los datos publicados estereológica la ASF, TSF, ssf, y Σ Q debe ser reportado a lo largo de los valores apropiados de la CE.
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Acknowledgments
Los autores desean agradecer a Ikiel Ptito por su apoyo técnico continuo. NSERC otorgar a MP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereologer | Stereology Resource Center (Chester, MD) | www.disector.com | |
| Stereology Tool-Kit Stereologer system | BioQuant Life Sciences (Nashville, TN) | ||
| StereoInvestigator | MBF Bioscience |
References
- West, M., Slomianka, L., Gundersen, H. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. Aat Rec. 231, 482-497 (1991).
- Saper, C. B. Any way you cut it: a new journal policy for the use of unbiased counting methods. J Comp Neurol. 364, 5-5 (1996).
- Sterio, D. C. The unbiased estimation of number and sizes of arbitrary particles using the disector. J Microsc. 134, 127-136 (1984).
- Mouton, P. R. Principles and Practices of Unbiased Stereology. , The Johns Hopkins University Press. Baltimore. (2002).
- Burke, M. W., Zangenehpour, S., Boire, D., Ptito, M. Dissecting the non-human primate brain in stereotaxic space. J Vis Exp. 29, (2009).
- Burke, M. W., Zangenehpour, S., Boire, D., Ptito, M. Brain banking: Making the most of your research. J Vis Exp. 29, (2009).
- Manaye, K. F., Wang, P., O'Neil, J., Huafu, S., Tizabi, Y., Thompson, N., Ottinger, M. A., Ingram, D. K., Mouton, P. R. Neuropathological Quantification Of Dtg APP/PS1: Neuroimaging, Stereology, And Biochemistry. AGE. 29, 87-96 (2009).
- Burke, M. W., Palmour, R. M., Ervin, F. R., Ptito, M. Neuronal reduction in frontal cortex of primates after prenatal alcohol exposure. Neuroreport. 20, 13-17 (2009).
- Zangenehpour, S., Burke, M. W., Chaudhuri, A., Ptito, M. Batch immunostaining for large-scale protein detection in the whole monkey brain. J Vis Exp. 29, (2009).
