知道重要的：无偏体视学在非人类灵长类动物的脑

Summary

在人体正常和病理条件下的灵长类动物的大脑解剖组织可以提供重要的见解。无偏体视学是一种准确，有效地估算总神经元的数量（或其他类型的细胞）在一个给定的参考空间的方法

Abstract

非人类灵长类动物是了解人类大脑的正常功能和疾病过程的一个重要平移物种。无偏体视学，接受国家的最先进的生物对象在组织切片进行量化的方法

Protocol

第1部分：前处理的组织应根据伯克等。 ^{（2009）5。}

1. 简单地说，组织应该得到很好的多聚甲醛，戊二醛，或福尔马林灌注。这可以通过标准transcardial，通常用于收获其他器官灌注。在本研究的主题是深刻的盐酸氯胺酮（10毫克/公斤，IM）与戊巴比妥钠（25毫克/公斤，四）过量安乐死，镇静剂和用0.1 M PBS灌注，直到完全exsanguinated transcardially人。其次是在PBS的4％多聚甲醛为5分钟（约1升）的解决方案。组织应paraformaldeyhde，gluteraldehyde，或福尔马林灌注。大脑应stereotaxically封锁，从头骨取出，称重，量确定，cryoprotected，并冻结^5。

第2部分：组织系统抽样，根据伯克等。 ^{（2009）6。}

1. 在这个例子中，我们将重点放在vervet脑额叶。参考空间被定义为包括左半球额极皮层组织从中央沟。该系列对于我们的目的是在整个大脑皮层的1 / 10节，在50μm的切片。一个完整的系列染色甲酚紫（＃1系列）。系列2分裂，因此，有一半的路段髓鞘的启示和乙酰胆碱酯酶的另一半染（划定一定的皮层下区）与氯化金染色。所有其他系列抗原保存，作为我们长期的研究计划的一部分库存。

第3部分：视学（更多详情，请参阅2002年木桐^） 4

1. （N）的手机号码，总的估计是基于下列公式计算：
   N = SSF -1 x ASF -1 x TSF -1 xΣQ -
   SSF是部分抽样比，ASF是该地区的抽样比例，TSF，如果厚度采样的分数（测量组织厚度划分是由剥离高度），ΣQ -计算利息的对象总数内剥离。此协议的下一个部分显示了如何确定的社保基金理事会，ASF，TSF和 Σ Q。
   
2. 第抽样比（非电脑为基础的）
   1. 完整的参考空间，必须明确界定，由前到后和背腹。在这个例子中，我们在额叶的兴趣，并定义为额极（前）的一角，以中央沟（后）和外侧沟（腹）地区，并排除岛。
   2. 对于这一特定主题的额叶，共760节，有系统地搜集76甲酚紫染色。由于目标是10个部分，整个参考空间的1 / 6甲酚紫染色切片取样，导致了大约1 / 60节中的示例分数。我们随机开始的第6甲酚紫染色部分之一和系统采样此后的1 / 6。一个13节，共抽样选定的主题（图2）。
3. 
   区域样本分数（计算机为基础的）
   
   1. 的试验研究表明最佳网格大小，区的抽样比例，约100-300 disectors样品的参考空间。在额叶，网格尺寸为2500微米²取得 ​​了平均254 disectors这个问题（图2）。 disector的大小，产量约0-5计算对象，在这种情况下，神经元之间。
4. 厚度样品组分（以计算机为基础）
   1. 在每个disector位置，测量组织的高度，这个高度的一小部分进行采样，这是已知厚度抽样比。要确定测量的厚度，重点通过z平面，直到第一个单元格来成为关注的焦点，然后备份轻微的部分，即顶部，直到出现的最后一个对象只是重点。要确定组织的底部，重点是通过z平面，直到细胞失焦勉强。
   2. 通过z平面为重点，细胞应在每一个深度染色，如果没有，这可能表明不完整的组织染色或非均匀脱水渗透，在这种情况下，部分应重新染色。这种预防措施是特别重要的免疫染色的组织，需要通过比较厚的组织切片immunoprobes渗透的。出于这个原因，免疫染色组织应轻轻counterstained嗜碱性染色（例如，甲酚紫，赫马toxylin）为了准确地判断顶部和底部的部分，并确认抗体的渗透。在这项研究中，部分在50μm的切片设置切片。毕竟组织处理完成后，测量组织厚度平均为17.9μm（图2），用了约65％的平均收缩。请注意，这些结果代表了典型的收缩处理组织常规病理^准备 7 。
   3. 默认为典型的研究disector高度为10μm。 disector高度和测量的部分厚度之间的区别是后卫身高，在没有生物的特点是计算量组织。卫兵高度的使用，避免在切片表面组织损伤（如丢失上限）。
5. 对象总数计算，ΣQ -
   1. 为了避免出现识别错误的偏见，这是一个标准的定义必须是特别感兴趣的生物特征。在这种情况下，我们感兴趣的计数神经元。因此，一个神经元被定义为一个位于市中心的可见核仁和细胞质明确界定，而神经胶质细胞普遍缺乏可见核仁和细胞质。对于这个问题的457神经元进行计数。

第4部分：Stereologer -一个计算机化的体视系统（体视学资源中心，切斯特，MD）

1. Stereologer系统提示用户填写必要的信息在一步一步的时尚。在“研究资料”一节中的参数确定的研究。由于参考空间必须被定义为研究对象，应选择体积参数（参考空间卡瓦列利估计应选择）。物体的体积也可以在此处选择估计数加权感兴趣的对象的人口数量。对于我们的例子中，只有量的参考空间被选中。对于每个对象，选择的数量和定义功能，在这种情况下，神经元的利息。
2. 案例初始化：是建立在本节中的抽样信息。输入板的采样间隔（如果单独组织切片详尽砖，每节按顺序放在然后请在这里输入1）。通过参考空间（在这种情况下，760），采取部分输入的总数。然后输入部分的取样时间间隔（在这种情况下，59）。然后，系统计算进行采样的部分（在这种情况下，13）。
3. 探头参数：本节定义了电网和disector大小。对于体积，使用低倍率2.5倍，10倍编辑“菜单下的定义网格间距。对象的放大倍数应在100X（NA 1.3或1.4）。帧面积disector的大小，在这种情况下，我们用50％的屏幕。帧高度disector厚度在10微米这里设置。帧间距网格的大小。在我们的试验研究中，我们发现，2500μm产量在150-200帧之间的间隔一致的方式通过一个比较大的参考空间的系统。对于规模较小的地区，应该使用较小的网格大小。的试验研究，确定为每个特定的研究的光学探头参数。
4. 一旦已经建立了研究参数，通过组织取样进行。程序将提示您样本第一部分第1步：低倍率下，程序会提示用户，跟踪上一节中的参考空间。然后系统将探头上的参数和用户基础的部分放在一个网格，然后将验证点内的参考空间。如果一个点是不是在参考空间点上只需点击并不会被计算入量第2步：系统将在参考空间放置一个新的网格，基于帧间隔参数。验证参考空间的交点属于第三步：然后系统会提示用户切换到高放大倍率的目标和移动舞台，第一次剥离第4步：此时系统会提示用户定义部分的顶部和底部，然后，系统设置采样空间， 在Z轴第 5步：用户将落在disector通过z平面内的每个对象，然后在。触碰红线或disector底部的对象，可能不被计算在内。一旦计算每个对象，然后单击下一步。该阶段将移动到下一个disector和重复4和5的步骤。一旦节disectors都被计算在内，系统会提示用户插入下一个连续的部分，被探测。将重复步骤1-5，直到所有的顺序部分被采样。该系统将提供ASF，SSF，TSF，和ΣQ计算。根据这些参数，系统将产生估计Ñ，参考量，估计的数量和体积的行政长官。它还将变得更有效率的建议或减少行政长官（图2） 。

第5部分：代表性的成果：

无偏体视学提供了参考空间内细胞群的有效和可靠的估计。有计算机为基础的体视系统，所有这些都依赖系统抽样和定义的参考空间。我们使用BioQuant生命科学系统的估计2岁vervets的大脑皮层神经元的总人口将​​超过828万（图3）与0.042的平均行政长官。我们随后使用Stereologer系统估计，额叶皮层神经元的一半左右⁸号帐户。

图1基于计算机的体视系统。一套基本的体视系统是相同的，在显微镜与机动阶段（XYZ），一个阶段控制器，摄像机，电脑，和软件。最终选择的系统应根据效率，需要和成本分析。

研究资料
研究名称	额叶皮质
首席研究员	MB
物种	公司
参考空间前腰	皮质
注释
案件信息
数据采集​​器	MB
日期	，2008年4月30日，日（星期三）
集团	控制
主题	O26
注释
采样特性
板坯采样间隔	1
各组的总人数	760
部分的取样时间间隔	59
开始第	2
馏分
业余	0.0002
SlabSF	1.0000
社保基金理事会	0.0169
TSF	0.5587

业绩摘要
参数	探头	名称	结果	行政长官	SD
厚度	---	---	17.8996μ	---	---
数	Disector	神经元	243833769.1473	0.0474	N / A
卷	卡瓦列利点网格	体积	1719769397954.1284μ^ 3	0.0078	N / A

建议
探头	对象编号（神经元）
行政长官	0.0474
建议	行政长官是可以接受的。
观看Disectors数过高，增加Disector间距。
探头	区卷（卷）
行政长官	0.0078
建议	行政长官是可以接受的。

部分结果
第	神经元NumObjects神经NumCorners	体积RegPoints
1。 40	48	34
2。 26	52	44
3。 29	56	48
4。 39	100	83
5。 49	112	83
6。 53	156	120
7。 65	128	106
8。 45	108	100
9。 52	100	77
10。 26	64	60
11。 21	44	44
12。 11	36	32
13。 1	12	6

图2结果Stereologer系统取得的泉叶 ，额叶，系统抽样和切片的体视学过程中最长的部分。完成了地形，体积和神经元的估计，在大约一天每个科目。左半球是采样的数量是在两个半球的近似估计的文本增加了一倍。

图3皮层神经元的人口估计与BioQuant获得。BioQuant系统需要一个确切的地形之前，细胞计数。在这里，平均13节进行了采样。皮质地形和后续量估计为15-20小时之间，每个主题。地形下一个2.5倍的目标和计数使用100倍的油浸物镜（NA 1.3）。每第100节被选为整个平均180采样disectors左半球。一旦完成地形神经元计数了大约一天。左半球是采样的数量是在两个半球的近似估计的文本增加了一倍。

Discussion

在灵长类动物的大脑无偏体视学与其它生物标本。然而，由于灵长类动物的大脑的大小，谨慎处理计划建议，因为一个单个半球的vervet猴子在50μm的切片时，产量超过1200节。首先，我们建议stereotaxically阻断大脑切成1cm的块，它提供了一个标准节块和学科之间的平面，最大限度地减少块之间的部分^路段 ，并提供管理的5大小的块。一个关键的体视步骤是系统抽样6-10节获得通过参考区域。对于灵长类动物的大脑，这使得大量的材料未处理，所以为了最大限度地发挥每个大脑的潜力，从获得的数据，我们建议银行在抗原^组织保持长期的研究计划6。当组织是库存，一个系统在猴子的大脑识别靶蛋白的免疫检测方法，可以^制备体视9。如皮质或耳垂较大的地区可能需要10-14节，所以切片计划之前应通过最小的参考空间的潜在利益至少10节。一个控制的问题上进行的试验研究，也应设置参数的体视学研究。此外介绍或解释公布的体视数据时，ASF，TSF，SSF，ΣQ应报告与相应的CE值。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereologer	Stereology Resource Center (Chester, MD)	www.disector.com
Stereology Tool-Kit Stereologer system	BioQuant Life Sciences (Nashville, TN)
StereoInvestigator	MBF Bioscience