Summary
Dissocier les cellules de différents types de tissus spécifiques requiert des paramètres spécifiques pour aggitation tissus pour obtenir un volume élevé de viabilité, de cellules cultivables. Le Miltenyi gentleMACS dissociateur optimise cette tâche avec un simple, protocole pratique. Dans cette publication, l'utilisation de cet appareil sur le tissu nerual est expliqué.
Abstract
Dans le système nerveux, des centaines de types de cellules neuronales et gliales ont été décrits. Chaque type de cellule spécifique dans le cerveau ou la moelle épinière a un répertoire de molécules de surface cellulaire, ou déterminants moléculaires, grâce auquel il peut être identifiée et caractérisée. Actuellement, l'identification de cellules robustes et les technologies de séparation nécessitent une seule cellule préparations destinées à être produites tout en limitant la mort cellulaire et la destruction des protéines de surface caractéristique. Le dissociateur gentleMACS, lorsqu'il est utilisé en combinaison avec la trypsine ou la papaïne basé kits de dissociation, peut efficacement et en douceur dissocient le tissu cérébral, tout en préservant épitopes d'antigènes et de limiter la perte de cellules. Préparation standardisée des suspensions unicellulaires est réalisé en utilisant les tubes C et optimisées, prédéfinies Programmes gentleMACS. Une fois produite, une seule cellule suspensions peuvent être traitées avec des conjugués monoclonaux comme anti-Prominin-1 microbilles, qui identifient les progéniteurs neuronaux, ou encore purifiée en utilisant des perles de suppression de myéline.
Protocol
Pour travailler dans des conditions stériles, il est recommandé d'effectuer toutes les étapes d'une hotte à flux laminaire.
1. Matériaux
- Neural Tissue Kit de dissociation (P) (Composants: Solution 1,2, 3 et 4, de stockage tampon)
- Pré-Séparation Filtres
- (Facultatif) Perles de suppression myéline
- Les bêta-mercaptoéthanol
- gentleMACS dissociateur
- C Tubes
- Rotator Tube MACSmix
- HBSS (w / o)
- HBSS (w)
- Préparer les solutions suivantes avant de commencer le protocole:
- Hanks solution saline tamponnée sans cations divalents Ca 2 + ou Mg 2 + (HBSS (w / o)
- HBSS, standard, c'est à dire avec Ca 2 + et Mg 2 + (HBSS (w)
- Selon l'épitope d'antigène d'intérêt dans les applications ultérieures, utilisez soit la papaïne à base de tissus neuronaux dissociation Kit (P) ou de la trypsine à base de tissus neuronaux dissociation Kit (T).
- Préparer les solutions suivantes de la dissociation des tissus neuronaux du kit:
- Solution 2: ajouter des bêta-mercaptoéthanol à 0,067 mM
- Solution 4: dissoudre la poudre dans 0,7 ml de tampon de stockage (fourni dans le kit), mélanger délicatement (ne pas vortexer)
- Mélanger une enzyme: Pipeter 1,9 ml de solution 2 et 50 ul de solution 1 (tous deux de kit) dans un tube C et incuber pendant 10-15 min à 37 ° C. Cela est suffisant pour dissocier de 400 mg de tissu cérébral.
2. Dissociant le tissu neural
- Peser le tissu cérébral dans un tube contenant 1 ml de HBSS (w / o)
- Transfert cerveau de souris dans le tube C contenant 1950 ul de mélange enzymatique préchauffé 1. (REMARQUE: ce protocole est rédigé pour ≤ 400 mg, mais les volumes de solution peut être adaptée pour accueillir jusqu'à 1600 mg de tissu cérébral par Tube C)
- Placer le tube C sur le dissociateur gentleMACS et exécutez le programme "m_brain_01".
- Incuber avec rotation (4 min en utilisant un tube Rotator MACSmix) pendant 15 min à 37 ° C.
- Placer le tube C sur le dissociateur gentleMACS et exécutez le programme "m_brain_02".
- Pendant l'étape de dissociation de préparer 30 pi de 2 Mix enzyme par 400 mg de tissu par un léger mélange de 20 ul de la solution 3 et 10 ul de la solution 4.
- Ajouter 2 mélange enzymatique du métro C via le septum scellé bouchon et mélanger doucement sans vortex.
- Incuber le tube C avec rotation pendant 10 min à 37 ° C dans un incubateur.
- Placer le tube C sur le dissociateur gentleMACS et exécutez le programme "m_brain_03".
- Incuber le tube C avec rotation pendant 10 min à 37 ° C dans un incubateur.
- Centrifuger brièvement pour prélever l'échantillon au fond du tube.
3. Filtration
- Sélectionner un assez grand filtre pour permettre le passage vers les cellules d'intérêt. Par exemple, les cellules de Purkinje sont trop grands pour passer à travers un filtre de 30 um, mais Prominin-1 + cellules.
- Utiliser une pipette suitable1000 ul pour éliminer les cellules forment le tube C à travers le septum scellé bouchon et l'appliquer à la pré-filtre de séparation sur un tube de prélèvement de 15 ml. (REMARQUE: pour des échantillons plus importants d'utiliser un tube de prélèvement de 50 ml).
- Laver le filtre avec 10 ml de HBSS (w).
- Centrifuger les cellules filtrées à 300 xg pendant 10 min à température ambiante.
- Reprendre le surnageant dans votre moyenne ou tampon de choix pour les applications ultérieures.
- Pour enlever les débris de myéline, l'utilisation Perles de suppression de myéline.
4. Résultat Représentant: S'il vous plaît voir Figures 1-3
Figure. 1 La dissociation du cerveau avec la dissociateur gentleMACS abouti à 97% de cellules viables, comme le montre l'analyse des flux de cytométrie.
Figure. 2 photo Microscope optique de la formation Neurosphère après tri cellulaire magnétique en utilisant Anti-Prominin-1 microbilles après 7 jours de culture dans MACS ® NeuroMedium complétée par MACS supplément B27 PLUS. Les cellules ont été préparées à partir de cerveau de souris CD1 (P3) en utilisant le tissu neural dissociation Kit (P).
Figure. 3 débris de myéline dans une seule cellule suspensions altère considérablement l'isolement cellulaire, et l'enlèvement des débris de myéline par les perles de suppression myéline accroît les séparations de cellules d'efficacité. Pour les séparations MACS utilisant Anti-Prominin-1 microbilles, P22 cerveau de souris a été dissociée en utilisant les tissus neuronaux dissociation Kit (P). Les cellules de la suspension à cellule unique ont été soit directement utilisé pour la séparation, ou ont été soumis à la myéline déplétion en utilisant des perles de suppression de myéline. En comparant la séparation à partir d'échantillons avec et sans suppression de la myéline, démontre que la pureté est supérieure pour les échantillons avec l'enlèvement de myéline précédente.
Discussion
Le dissociateur gentleMACS facilite la préparation standardisée des suspensions unicellulaires à partir des tissus neuraux dans un système fermé. Neural Tissue Kits de dissociation sont optimisés pour préserver épitopes antigène nécessaire pour d'autres applications comme les immunomarquages et la séparation des cellules immuno 1-5. Dans ce protocole, nous montrons la dissociation enzymatique doux de cerveau de souris en utilisant les dissociateur gentleMACS et le tissu neural dissociation Kit (P), ce qui donne dans 97% des cellules viables. 100 mg de tissu neural entre les rendements 5x10 et 1x10 6 7 cellules, en fonction de l'âge du tissu hôte. La cible Prominin-1 + cellules ont été isolées à l'aide anti-Prominin-1 microbilles et ensuite repris dans la culture. Le protocole est indiqué pour être encore plus efficace avec l'utilisation additionnelle de perles de suppression myéline quand on travaille avec les tissus nerveux provenant de souris> P7.
Disclosures
Les auteurs sont des employés de Miltenyi Biotec GmbH, Allemagne.
Materials
References
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