Summary
Disociar las células de tipos específicos de tejido requiere de parámetros específicos para aggitation tejido para obtener un alto volumen de células viables, cultivables. El Miltenyi gentleMACS disociador optimiza esta tarea con un protocolo simple y práctico. En esta publicación, el uso de este aparato en el tejido nerual se explica.
Abstract
Dentro del sistema nervioso, cientos de tipos de células neuronales y gliales han sido descritos. Cada tipo específico de célula en el cerebro o la médula espinal tiene un repertorio de moléculas de superficie celular, o determinantes moleculares, a través del cual pueden ser identificados y caracterizados. En la actualidad, la identificación de células robusto y tecnologías de separación requiere una sola célula preparaciones que se generen al mismo tiempo limitar la muerte celular y la destrucción de la proteína de la superficie característica. El disociador gentleMACS, cuando se utiliza en combinación con tripsina o papaína más los paquetes de la disociación, puede con eficacia y suavidad disociar el tejido cerebral, mientras que la preservación de los epítopos del antígeno y la limitación de la pérdida de células. Preparación estandarizada de una sola célula suspensiones se consigue mediante tubos de C y los programas optimizados preestablecidos gentleMACS. Una vez generados, una sola célula suspensiones pueden ser tratadas con los conjugados monoclonales como el anti-Prominin-1 MicroBeads, que identifican progenitores neurales, o purificado utilizando bolas de mielina eliminación.
Protocol
Para trabajar en condiciones estériles, se recomienda llevar a cabo todos los pasos en una campana de flujo laminar.
1. Materiales
- La disociación del tejido neural Kit (P) (Componentes: Solución de 1,2, 3 y 4, del buffer de almacenamiento)
- Separación de los pre-filtros
- (Opcional) La mielina bolas de eliminación
- Beta-mercaptoetanol
- gentleMACS disociador
- C Tubos
- MACSmix rotador del tubo
- HBSS (w / o)
- HBSS (w)
- Prepare las siguientes soluciones antes de iniciar el protocolo:
- Buffered Hanks Solución salina sin cationes divalentes Ca 2 + o Mg 2 + (HBSS (w / o)
- HBSS, estándar, es decir, con Ca 2 + y Mg 2 + (HBSS (w)
- Dependiendo del epítopo del antígeno de interés en las aplicaciones posteriores, utilice la papaína basada en tejidos neuronales disociación Kit (P) o la tripsina basada en tejidos neuronales disociación Kit (T).
- Prepare las siguientes soluciones de Neural tejidos disociación del kit:
- Solución 2: añadir beta-mercaptoetanol al 0,067 mM
- Solución 4: disolver el polvo en 0,7 ml de Buffer de almacenamiento (incluye en el kit), mezcle suavemente (no vortex)
- Mezcle una enzima: Pipetear 1,9 ml de la Solución 2 y 50 l Solución 1 (tanto de equipo) en un tubo C e incubar durante 10-15 min a 37 ° C. Esto es suficiente para disociar 400 mg de tejido cerebral.
2. Disociar el tejido neural
- Pesar el tejido cerebral en un tubo que contiene 1 ml HBSS (w / o)
- Transferencia de cerebro de ratón en el tubo C que contiene 1950 l de mezcla de enzimas precalentado 1. (NOTA: este protocolo está destinado a ≤ 400 mg, pero los volúmenes de solución se pueden ampliar para dar cabida a hasta 1600 mg de tejido cerebral por tubo C)
- Coloque el tubo de C en el disociador gentleMACS y ejecutar el programa "m_brain_01".
- Incubar con la rotación (4 rpm con un rotor de tubo MACSmix) durante 15 minutos a 37 ° C.
- Coloque el tubo de C en el disociador gentleMACS y ejecutar el programa "m_brain_02".
- Durante el paso de la disociación preparar 30 l de mezcla de enzimas del 2 por 400 mg de tejido con cuidado mezcla de 20 l de solución de 3 y 10 l de solución 4.
- Añadir la mezcla de enzimas 2 del metro a través de la C-tabique sellado tapa y mezcle suavemente sin agitación.
- Incubar el tubo C con rotación de 10 min a 37 ° C en una incubadora.
- Coloque el tubo de C en el disociador gentleMACS y ejecutar el programa "m_brain_03".
- Incubar el tubo C con rotación de 10 min a 37 ° C en una incubadora.
- Centrifugar brevemente para recoger la muestra en la parte inferior del tubo.
3. Filtración
- Seleccione un filtro lo suficientemente grandes para permitir el paso de las células de interés. Por ejemplo, las células de Purkinje son demasiado grandes para pasar a través de un filtro de 30 micras, pero Prominin-1 + células.
- Use una pipeta de l suitable1000 para eliminar las células forma el tubo de C a través del tabique sellado la tapa y aplicarlo a la Pre-filtro de separación en un tubo de recogida de 15 ml. (NOTA: para mayor tamaño de la muestra utiliza un tubo de recogida de 50 ml).
- Lavar el filtro con 10 ml de HBSS (w).
- Centrifugar las células filtrada a 300 xg durante 10 min a temperatura ambiente.
- Resuspender el sobrenadante en el medio o de amortiguamiento de la elección para aplicaciones posteriores.
- Para eliminar los restos de mielina, la mielina utilizar bolas de eliminación.
4. Resultados representante: Por favor, véanse las Figuras 1-3
Figura. 1 La disociación del cerebro con el disociador gentleMACS resultó en 97% las células viables, como lo muestra el flujo de análisis de citometría.
Figura. 2 imagen microscopio de luz de la formación de neuroesfera después de la clasificación de células magnético utilizando Anti-Prominin-1 MicroBeads después de 7 días de cultivo en MACS ® NeuroMedium complementado con MACS Suplemento B27 PLUS. Las células fueron preparados a partir de cerebro de ratón CD1 (P3), utilizando el tejido neural disociación Kit (P).
Figura. 3 restos de mielina en una sola célula suspensiones constituyendo una grave amenaza de aislamiento de células y la eliminación de los residuos de mielina por bolas eliminación de mielina aumenta la eficiencia de separación celular. Las separaciones de MACS con Anti-Prominin-1 MicroBeads, P22 cerebro de ratón se disocian con el tejido neural disociación Kit (P). Las células de la suspensión de una sola célula eran utilizados directamente para la separación, o se presentaron a la mielina agotamiento utilizando bolas de mielina eliminación. Comparación de la separación de las muestras con y sin la eliminación de mielina, demuestra que la pureza es mayor para las muestras con la eliminación de mielina anterior.
Discussion
El disociador gentleMACS facilita la preparación estandarizada de una sola célula suspensiones de tejidos nerviosos en un sistema cerrado. Neuronal del tejido Kits disociación están optimizados para conservar epítopos antígeno necesario para otras aplicaciones como immunostainings y separación celular inmunomagnética 1-5. En este protocolo se muestra la disociación enzimática suave del cerebro del ratón con el disociador gentleMACS y el tejido neural disociación Kit (P), produciendo en las células de un 97% viable. 100 mg de tejido nervioso entre los rendimientos de 5x10 6 y 1x10 7 células, dependiendo de la edad de los tejidos del huésped. El objetivo 1 Prominin células + fueron aislados usando Anti-Prominin-1 MicroBeads y luego fueron a la cultura. El protocolo se demuestra que es aún más eficaz con el uso adicional de bolas de eliminación de la mielina cuando se trabaja con el tejido neural derivados de ratones P7>.
Disclosures
Los autores son empleados de Miltenyi Biotec GmbH, Alemania.
Materials
References
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