Summary
Ta avstånd celler från specifika vävnadstyper kräver särskild parametrar för vävnad aggitation att få en stor mängd livskraftiga, odlingsbara celler. Den Miltenyi gentleMACS Dissociator optimerar denna uppgift med en enkel, praktisk protokoll. I denna publikation användning av denna apparat på nerual vävnad förklaras.
Abstract
Inom nervsystemet, har hundratals neuronala och glia celltyper har beskrivits. Varje specifik celltyp i hjärnan eller ryggmärgen har en repertoar av molekyler cellens yta eller molekylära faktorer, genom vilket det kan identifieras och karakteriseras. För närvarande robust cell identifiering och teknik separation kräver encelliga preparat som skall genereras samtidigt begränsa celldöd och förstörelse av karakteristiska ytan protein. Den gentleMACS Dissociator, när det används i kombination med trypsin eller papain-baserade dissociation kit, kan effektivt och skonsamt ta avstånd hjärnvävnad samtidigt antigen epitoper och begränsa cell förlust. Standardiserade beredning av encelliga upphängningar uppnås med C Rör och optimerad, förinställda gentleMACS program. När genereras, encelliga suspensioner kan behandlas med monoklonala konjugat som anti-Prominin-1 mikrokulor, som identifierar neurala stamceller, eller renas ytterligare med Myelin Borttagning pärlor.
Protocol
Att arbeta under sterila förhållanden, är det rekommenderat att utföra alla steg i ett laminärt flöde huva.
1. Material
- Neural vävnadsdissociering Kit (P) (Komponenter: Lösning 1,2, 3 och 4, Storage Buffer)
- Pre-Separation filter
- (Valfritt) Myelin Borttagning Pärlor
- Beta-merkaptoetanol
- gentleMACS Dissociator
- C Rör
- MACSmix Tube Rotator
- HBSS (w / o)
- HBSS (W)
- Förbered följande lösningar innan du påbörjar protokollet:
- Hanks buffrad saltlösning utan divalenta katjoner Ca 2 + eller Mg 2 + (HBSS (w / o)
- HBSS, standard, dvs med Ca 2 + och Mg 2 + (HBSS (W)
- Beroende på antigenet epitop intresset för efterföljande ansökningar, använd antingen Papain-baserade Neural vävnadsdissociering Kit (P) eller Trypsin-baserade Neural vävnadsdissociering Kit (T).
- Förbered följande lösningar från Neural vävnadsdissociering Kit:
- Lösning 2: Lägg beta-merkaptoetanol till 0,067 mM
- Lösning 4: lös pulvret i 0,7 ml Storage Buffer (medföljer i satsen), blanda försiktigt (inte vortex)
- Enzym Blanda 1: Pipettera 1,9 ml 2 och 50 l Lösning 1 (båda från satsen) i en C Tube och inkubera i 10-15 minuter vid 37 ° C. Det är tillräckligt för att skilja 400 mg hjärnvävnad.
2. Ta avstånd till nervvävnad
- Väg hjärnvävnad i ett rör innehållande 1 ml HBSS (w / o)
- Överför musen hjärnan i C Tube innehåller 1950 ìl förvärmd Enzyme Blanda 1. (OBS: Detta protokoll är skrivet för ≤ 400 mg, men lösningen volymer kan skalas för att rymma upp till 1600 mg hjärnvävnad per C Tube)
- Placera C Tube på gentleMACS Dissociator och kör programmet "m_brain_01".
- Inkubera med rotation (4 varv med hjälp av en MACSmix Tube Rotator) i 15 minuter vid 37 ° C.
- Placera C Tube på gentleMACS Dissociator och kör programmet "m_brain_02".
- Under dissociation steg fram 30 l enzym Blanda 2 per 400 mg av vävnad genom att försiktigt blanda 20 l av lösning 3 och 10 ìl av lösning 4.
- Lägg till Enzyme Blanda 2 till C Tube via membranet förslutna lock och blanda försiktigt utan vortexa.
- Inkubera C Tube med rotation i 10 min vid 37 ° C i en inkubator.
- Placera C Tube på gentleMACS Dissociator och kör programmet "m_brain_03".
- Inkubera C Tube med rotation i 10 min vid 37 ° C i en inkubator.
- Centrifugera kort att samla prov på botten av röret.
3. Filtrering
- Välj ett filter stort nog att tillåta passage till cellerna av intresse. Till exempel Purkinje celler är för stora för att passera ett 30 ìm filter, men Prominin-1 + celler.
- Använd en suitable1000 l pipett för att ta bort de celler bildar C Tube genom membranet förslutna mössa och tillämpa den på försepareringen filter på ett 15 ml provrör. (OBS: för en större stickprovsstorlekar använda en 50 ml provrör).
- Tvätta filtret med 10 ml HBSS (W).
- Centrifugera filtreras cellerna vid 300 xgi 10 minuter vid RT.
- Resuspendera supernatent i ditt medium eller buffert i valet för senare ansökningar.
- För att ta bort myelin skräp, använd Myelin Removal pärlor.
4. Representativt resultat: Se diagram 1-3
Figur. 1 Hjärnan dissociation med gentleMACS Dissociator resulterade i 97% livskraftiga celler som flödescytometrisk analys visar.
Figur. 2 ljusmikroskop bild av neurosphere bildas efter magnetiska cellsortering med Anti-Prominin-1 mikrokulor efter 7 dagars odling i MACS ® NeuroMedium kompletteras med MACS supplement B27 PLUS. Celler var beredda från CD1 mus hjärnan (P3) med hjälp av neurala vävnadsdissociering Kit (P).
Figur. 3 Myelin skräp i encelliga suspensioner försämrar avsevärt cell isolering och borttagning av myelin skräp genom Myelin Borttagning Pärlor ökar separationer effektiviteten cell. För MACS separationer med Anti-Prominin-1 mikrokulor var P22 musen hjärnan dissocierade använder Neural vävnadsdissociering Kit (P). Celler från encelliga fjädring var antingen direkt används för separation, eller lämnades till myelin utarmning med Myelin Borttagning pärlor. Jämföra separationen från prover med och utan myelin borttagning, visar att renhet är högre för prover med tidigare myelinet borttagning.
Discussion
Den gentleMACS Dissociator underlättar standardiserade beredningen av encelliga suspensioner från neurala vävnader i ett slutet system. Neural vävnadsdissociering Kits är optimerade för att bevara antigen epitoper som behövs för ytterligare applikationer som immunostainings och immunomagnetic cellseparation 1-5. I detta protokoll visar vi den milda enzymatiska dissociation av musen hjärnan använder gentleMACS Dissociator och neurala vävnadsdissociering Kit (P), vilket ger i 97% livskraftiga celler. 100 mg nervvävnad ger mellan 5x10 6 och 1x10 7 celler, beroende på ålder värdvävnaden. De riktade Prominin-1 + celler var isoleras med hjälp av anti-Prominin-1 mikrokulor och därefter tas i kulturen. Protokollet visar sig vara ännu mer effektiv med ytterligare användning av myelin Removal pärlor när du arbetar med nervvävnad från möss> P7.
Disclosures
Författarna är anställda i Miltenyi Biotec GmbH, Tyskland.
Materials
References
- Hardt, O., Scholz, C., Küsters, D., Yanagawa, Y., Pennartz, S., Cremer, H., Bosio, A. Gene expression analysis defines differences between region-specific GABAergic neurons. Mol Cell Neurosci. 39, 418-428 (2008).
- Lee, J. K., McCoy, M. K., Harms, A. S., Ruhn, K. A., Gold, S. J., Tansey, M. G. Regulator of G-protein signaling 10 promotes dopaminergic neuron survival via regulation of the microglial inflammatory response. J Neurosci. 28, 8517-8528 (2008).
- Környei, Z., Gócza, E., Rühl, R., Orsolits, B., Vörös, E., Szabó, B., Vágovits, B., Madarász, E. Astroglia-derived retinoic acid is a key factor in glia-induced neurogenesis. FASEB J. 21, 2496-2509 (2007).
- Meylan, F., Davidson, T. S., Kahle, E., Kinder, M., Acharya, K., Jankovic, D., Bundoc, V., Hodges, M., Shevach, E. M., Keane-Myers, A., Wang, E. C., Siegel, R. M. The TNF-family receptor DR3 is essential for diverse T cell-mediated inflammatory diseases. Immunity. 29, 79-89 (2008).
- Skog, J., Würdinger, T., van Rijn, S., Meijer, D. H., Gainche, L., Sena-Esteves, M., Curry, W. T. Jr, Carter, B. S., Krichevsky, A. M., Breakefield, X. O. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nat Cell Biol. 10, 1470-1476 (2008).
