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Biology

Generazione di Single-Cell Sospensioni dal tessuto neurale del mouse

doi: 10.3791/1267 Published: July 7, 2009

Summary

Dissociare cellule di tipi di tessuto specifico richiede parametri specifici per aggitation tessuto per ottenere un elevato volume di vitali, cellule coltivabili. Il Miltenyi gentleMACS dissociatore ottimizza questa operazione con un semplice protocollo pratico. In questa pubblicazione l'utilizzo di questo apparecchio sul tessuto nerual è spiegato.

Abstract

All'interno del sistema nervoso, centinaia di tipi di cellule neuronali e gliali sono stati descritti. Ogni tipo di cellule specifiche del cervello o del midollo spinale ha un repertorio di molecole di superficie cellulare, o determinanti molecolari, attraverso i quali può essere identificato e caratterizzato. Attualmente l'identificazione delle cellule robuste e richiedono tecnologie di separazione a cella singola preparati da generare al tempo stesso limitare la morte cellulare e la distruzione delle proteine ​​di superficie caratteristico. Il dissociatore gentleMACS, se usato in combinazione con tripsina o la papaina kit a base di dissociazione, può efficacemente e delicatamente dissociare tessuto cerebrale, preservando epitopi dell'antigene e limitare la perdita di cellule. Preparazione standardizzata di singola cellula sospensioni è ottenuta utilizzando tubi C e ottimizzato, programmi preimpostati gentleMACS. Una volta generato, cella singola sospensioni possono essere trattati con coniugati monoclonali come Anti-Prominin-1 microsfere, che identificano progenitori neurali, o ulteriormente purificato utilizzando perline di rimozione mielina.

Protocol

Per lavorare in condizioni sterili, si raccomanda di eseguire tutti i passaggi in una cappa a flusso laminare.

1. Materiale

  • Neurali del tessuto dissociazione Kit (P) (Componenti: Soluzione 1,2, 3 e 4, buffer di memoria)
  • Pre-filtri di separazione
  • (Opzionale) Mielina rimozione Beads
  • Beta-mercaptoetanolo
  • gentleMACS dissociatore
  • C Tubi
  • MACSmix tubo Rotator
  • HBSS (w / o)
  • HBSS (w)
  1. Preparare le seguenti soluzioni prima di iniziare la procedura:
    1. Sale Hanks 'Soluzione tampone senza cationi bivalenti Ca 2 + o Mg 2 + (HBSS (w / o)
    2. HBSS, standard, cioè con Ca 2 + e Mg 2 + (HBSS (w)
  2. A seconda del epitopo dell'antigene di interesse per le applicazioni successive, utilizzare la papaina a base di tessuto neurale dissociazione Kit (P) o la tripsina a base di tessuto neurale dissociazione Kit (T).
  3. Preparare le seguenti soluzioni dal tessuto neurale dissociazione Kit:
    1. Soluzione 2: aggiungere beta-mercaptoetanolo a 0,067 mM
    2. Soluzione 4: sciogliere polvere in 0,7 ml di buffer di archiviazione (fornito nel kit), mescolare delicatamente (non vortex)
    3. Enzyme Mix 1: Pipettare 1,9 mL Soluzione 2 e 50 ul di soluzione 1 (entrambi da kit) in un tubo C e incubare per 10-15 minuti a 37 ° C. Questo è sufficiente a dissociarsi 400 mg di tessuto cerebrale.

2. Dissociare il tessuto nervoso

  1. Pesare tessuto cerebrale in una provetta contenente 1 ml HBSS (w / o)
  2. Trasferimento cervello di topo nel tubo C contenente 1950 ml di Enzyme Mix preriscaldato 1. (NOTA: questo protocollo è scritto per ≤ 400 mg, ma volumi di soluzione può essere scalata a ospitare fino a 1600 mg di tessuto cerebrale per tubo C)
  3. Posizionare il tubo C sul dissociatore gentleMACS ed eseguire il programma "m_brain_01".
  4. Incubare con rotazione (4 giri al minuto usando un tubo Rotator MACSmix) per 15 minuti a 37 ° C.
  5. Posizionare il tubo C sul dissociatore gentleMACS ed eseguire il programma "m_brain_02".
  6. Durante la fase di dissociazione preparare 30 ml di Enzyme Mix 2 per 400 mg di tessuto con delicatezza mescolando 20 ml di soluzione 3 e 10 ml di soluzione 4.
  7. Aggiungi Enzyme Mix 2 al tubo C attraverso il setto-sigillato tappo e mescolare delicatamente senza vortex.
  8. Incubare la provetta C con rotazione per 10 minuti a 37 ° C in un incubatore.
  9. Posizionare il tubo C sul dissociatore gentleMACS ed eseguire il programma "m_brain_03".
  10. Incubare la provetta C con rotazione per 10 minuti a 37 ° C in un incubatore.
  11. Centrifugare brevemente per raccogliere il campione al fondo della provetta.

3. Filtrazione

  1. Selezionare un filtro abbastanza grande per consentire il passaggio alle cellule di interesse. Per esempio, cellule di Purkinje sono troppo grandi per passare attraverso un filtro di 30 micron, ma Prominin-1 + cellule.
  2. Utilizzare una pipetta suitable1000 microlitri per rimuovere le cellule formano il tubo C il setto-tappo sigillato e applicarlo al pre-filtro di separazione su un tubo di raccolta da 15 ml. (NOTA: per le dimensioni del campione più ampio utilizzare un tubo di raccolta da 50 ml).
  3. Lavare il filtro con 10 ml di HBSS (w).
  4. Centrifugare le cellule filtrata a 300 xg per 10 minuti a temperatura ambiente.
  5. Risospendere il supernatent nel medio o tampone di scelta per le applicazioni successive.
  6. Per rimuovere i detriti della mielina, utilizzare Beads rimozione mielina.

4. Risultato rappresentante: Si prega di vedere figure 1-3

fig 1
Figura. 1 La dissociazione cervello con il dissociatore gentleMACS portato a 97% cellule vitali, come dimostra la citometria a flusso.

fig 2
Figura. 2 foto microscopio Luce di formazione neurosfere dopo l'ordinamento delle cellule magnetico utilizzando Anti-Prominin-1 microsfere dopo 7 giorni di coltivazione in MACS ® NeuroMedium integrato con MACS supplemento B27 PLUS. Le cellule sono state preparate dal CD1 cervello di topo (P3) con il tessuto neurale dissociazione Kit (P).

Fig. 3.5
Figura. 3 detriti mielina in cella singola sospensioni un notevole pericolo per l'isolamento delle cellule, e la rimozione di detriti mielina da Perline rimozione mielina separazioni aumenta l'efficienza delle cellule. Per le separazioni MACS con Anti-Prominin-1 microsfere, P22 cervello di topo era dissociato con il tessuto neurale dissociazione Kit (P). Cellule dalla cella singola sospensione sono state direttamente utilizzate per la separazione, o sono stati sottoposti al depauperamento della mielina con perline di rimozione mielina. Confrontando la separazione da campioni, senza e con la rimozione della mielina, dimostra che la purezza è maggiore per i campioni con la rimozione della mielina precedente.

Discussion

Il dissociatore gentleMACS facilita la preparazione standardizzata di singole cellule sospensioni dai tessuti neurali in un sistema chiuso. Neurali del tessuto kit dissociazione sono ottimizzati per preservare epitopi antigene necessaria per ulteriori applicazioni, come immunostainings e la separazione delle cellule immunomagnetica 1-5. In questo protocollo si mostra la dissociazione dolce enzimatica di cervello di topo utilizzando il dissociatore gentleMACS e il tessuto neurale dissociazione Kit (P), ottenendo nel 97% cellule vitali. 100 mg di rendimenti tra il tessuto neurale 5x10 1x10 6 e 7 celle, a seconda dell'età del tessuto ospite. Il mirati Prominin-1 + sono state isolate le cellule utilizzando Anti-Prominin-1 microsfere e successivamente presi in cultura. Il protocollo è dimostrato di essere ancora più efficace con l'uso aggiuntivo di Perline rimozione mielina quando si lavora con i tessuti neurali derivate da topi P7>.

Disclosures

Gli autori sono dipendenti di Miltenyi Biotec GmbH, Germania.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C Tubes Miltenyi Biotec Order no. 130-093-237 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx
gentleMACS™ Starting Kit Miltenyi Biotec Order no. 130-093-235 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx
MACSmix™ Tube Rotator Miltenyi Biotec Order no. 130-090-753 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx
Neural Tissue Dissociation Kit (P) Miltenyi Biotec Order no. 130-092-628 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_656_Neural_Tissue_Dissociation_Kits.aspx
Pre-Separation Filters Miltenyi Biotec Order no. 130-041-407 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_247_Pre_Separation_Filters.aspx
Anti-Prominin-1 MicroBeads Miltenyi Biotec Order no. 130-092-333 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_654_524_Anti_Prominin_1_MicroBeads.aspx
Anti-Prominin-1-APC Miltenyi Biotec Order no. 130-092-335 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_525_Anti_Prominin_1.aspx
Myelin Removal Beads Miltenyi Biotec Order no. 130-094-544 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_688_Myelin_Removal_Beads.aspx
Art 1000 Reach Pipet Tips Molecular BioProducts Order no. 2079 http://www.mbpinc.com/ASP/products.aspx?query_TipID=61
http://www.mbpinc.com/html/products/art/display.html
Neural Tissue Dissociation Kit (T) Miltenyi Biotec Order no. 130-093-231 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_656_Neural_Tissue_Dissociation_Kits.aspx
Propidium Iodide Solution Miltenyi Biotec Order no. 130-093-233 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx

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References

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Pennartz, S., Reiss, S., Biloune, R., Hasselmann, D., Bosio, A. Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue. J. Vis. Exp. (29), e1267, doi:10.3791/1267 (2009).More

Pennartz, S., Reiss, S., Biloune, R., Hasselmann, D., Bosio, A. Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue. J. Vis. Exp. (29), e1267, doi:10.3791/1267 (2009).

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