Summary
특정 조직 유형의 세포를 Dissociating하면 조직 aggitation에 대한 특정 매개 변수가 가능한, culturable 세포의 높은 볼륨을 얻기 위해 필요합니다. Miltenyi gentleMACS Dissociator은 간단하고 실용적인 프로토콜이 작업을 최적화합니다. 이 발행물에서 nerual 조직이 장치의 사용이 설명되어 있습니다.
Abstract
신경계 내에의 연결 및 glial 세포 유형의 수백이 설명되었습니다. 뇌 또는 척수의 각 특정 세포 유형은 세포 표면 분자, 또는 그것이 식별하고 특성화 할 수있는을 통해 분자 determinants의 레파토리가 있습니다. 현재, 강력한 세포 식별 및 분리 기술은 동시에 특성 표면 단백질의 세포 죽음과 파괴를 제한하면서 단일 셀 준비가 생성해야합니다. 항원 epitopes을 보존하고 셀 손실을 제한하면서 트립신 또는 papain 기반 분리 키트와 함께 사용 gentleMACS Dissociator는 효과적이고 부드럽게 뇌 조직을 떼어 놓다 수 있습니다. 단일 셀 suspensions의 표준화 준비는 C 튜브 및 최적화, 미리 gentleMACS 프로그램을 사용하여 이루어진다. 일단 생성, 단일 셀 suspensions는 신경 progenitors을 식별하거나, Myelin 제거 비즈를 사용하여 더욱 정화 방지 Prominin - 1 MicroBeads 같은 단클론 conjugates로 치료하실 수 있습니다.
Protocol
무균 조건 하에서 해결하려면, 그것은 층류 후드의 모든 단계를 수행하는 것이 좋습니다.
1. 자료
- 신경 조직 분리 키트 (P) (구성 : 솔루션 1,2, 3, 4, 스토리지 버퍼)
- 사전 분리 필터
- (선택 사항) Myelin 제거 비즈
- 베타 - 메르 캅 토 에탄올
- gentleMACS Dissociator
- C 튜브
- MACSmix 튜브의 회전
- HBSS (W / O)
- HBSS (W)
- 이전 프로토콜을 시작하려면 다음 솔루션을 준비 :
- 이가의 양이온없이 행크스 '버퍼 소금 솔루션 칼슘 2 + 또는 MG 2 + (HBSS (W / O)
- HBSS, 표준, 즉 칼슘 2 +와 MG 2 + (HBSS (W)
- 이후 애플 리케이션에 대한 관심의 항원 에피토프에 따라 중 Papain 기반의 신경 조직 분리 키트 (P) 또는 트립신 기반의 신경 조직 분리 키트 (T)를 사용합니다.
- 신경 조직 분리 키트에서 다음 솔루션을 준비 :
- 해결 방법 2 : 0.067 mm까지 베타 메르 캅 토 에탄올을 추가
- 솔루션 4 : 0.7 ML 저장소 버퍼 (키트에서 제공)에 분말을 용해, 부드럽게 (소용돌이하지 않음) 믹스
- 효소 배합 1 : C 튜브와 10-15 분 부화에 피펫 1.9 ML 솔루션이 50 μl 솔루션 1 (키트에서 모두) 37 ° C. 이것은 뇌 조직을 떼어 놓다 400 밀리그램하기에 충분합니다.
2. 신경 조직을 Dissociating
- 1 ML HBSS (W / O)이있는 튜브의 뇌 조직을 달다
- preheated 효소 혼합 1 1,950 μL를 포함하는 C 튜브에 마우스 머리를 전송합니다. (참고 :이 프로토콜은 ≤ 400 밀리그램에 대한 기록이지만, 솔루션 볼륨 C 튜브마다 뇌 조직의 1600 MG 최대 수용 확장할 수 있습니다)
- gentleMACS의 Dissociator에 C 튜브를 삽입하고 프로그램 "m_brain_01"를 실행합니다.
- 37 15 분에 대한 회전 (MACSmix 튜브의 회전을 사용하여 4 RPM)를 품어 ° C.
- gentleMACS의 Dissociator에 C 튜브를 삽입하고 프로그램 "m_brain_02"를 실행합니다.
- 분리 단계 동안 부드럽게 솔루션 솔루션 3 사 10 μl 20 μl를 혼합하여 조직의 400 밀리그램 당 효소 혼합이 30 μl를 준비합니다.
- 심장 - 봉인 캡을 통해 C 튜브에 효소 혼합 2 추가하고 vortexing없이 부드럽게 섞는다.
- 37 C 튜브 10 분에 대한 회전 ° 배양기에서 C를 품어.
- gentleMACS의 Dissociator에 C 튜브를 삽입하고 프로그램 "m_brain_03"를 실행합니다.
- 37 C 튜브 10 분에 대한 회전 ° 배양기에서 C를 품어.
- 튜브의 하단에있는 샘플을 수집하기 위해 간단히 원심 분리기.
3. 여과법
- 관심의 세포 통로를 허용하도록 필터 큰만큼을 선택합니다. 예를 들어, Purkinje 세포는 30 μm의 필터를 통과하기에는 너무 큰 있지만, Prominin - 1 + 세포는 것입니다.
- 세포를 제거하는 suitable1000 μl 피펫을 사용 심장 - 봉인 캡을 통해 C 튜브를 형성하고 15 ML 수집 관의 사전 분리 필터를 적용해야합니다. (참고 : 큰 샘플 크기는 50 ML 수집 관을 사용하는 경우).
- HBSS (W) 10 ML과 필터를 씻으십시오.
- RT 10 분 300 XG에서 필터링된 세포를 원심 분리기.
- 후속 응용 프로그램에 대한 중간 또는 선택의 버퍼에 supernatent을 Resuspend.
- myelin의 파편을 제거하려면, Myelin 제거 비즈를 사용합니다.
4. 대표 결과 : 숫자 1-3를 참조하십시오
그림. gentleMACS의 Dissociator 1 뇌 분리는 흐름 cytometric 분석이 보여주는 것처럼, 97% 가능한 세포의 결과.
그림. neurosphere 형성 2 라이트 현미경 사진은 자기 세포 정렬 후 맥의 재배 7 일 후 안티 Prominin - 1 MicroBeads를 사용하여 ® NeuroMedium는 맥에서 보충 B27 플러스와 함께 보충. 세포는 신경 조직 분리 키트 (P)를 사용 CD1 마우스 뇌 (P3)에서 준비되었다.
그림. 단일 셀 suspensions 3 Myelin의 파편이 상당히 세포 절연 impairs 및 Myelin 제거 비즈로 myelin 파편의 제거 효율 전지 분판을 증가시킵니다. 안티 Prominin - 1 MicroBeads을 사용하여 Mac에서 분리 들어, P22 마우스 두뇌 신경 조직 분리 키트 (P)를 사용하여 dissociated되었습니다. 단일 세포 현탁액의 세포가 직접 분리에 사용되었다, 또는 Myelin 제거 비즈를 사용하여 고갈을 myelin에 제출했다. , myelin 제거없이 함께 시료의 분리를 비교하면 순수 이전 myelin 제거와 함께 샘플 높다는 것을 설명합니다.
Discussion
gentleMACS Dissociator는 닫힌 시스템에서 신경 조직에서 단일 셀 suspensions의 표준 준비를 용이하게합니다. 신경 조직 분리 키트는 immunostainings 및 immunomagnetic 세포 분리 1-5와 같은 추가 응용 프로그램에 필요한 항원 epitopes을 보존하기 위해 최적화되었습니다. 이 프로토콜에서는 97% 가능한 세포에 항복, gentleMACS Dissociator과 신경 조직 분리 키트 (P)를 사용하여 마우스 두뇌의 부드러운 효소 분해를 보여줍니다. 5x10 6 호스트 조직의 연령에 따라 1x10 7 세포 사이에 신경 조직 수익률 100 MG. 대상 Prominin - 1 + 세포는 안티 Prominin - 1 MicroBeads를 사용하여 절연하고 이후 문화로 이동했다. 프로토콜은 쥐> P7에서 파생된 신경 조직과 함께 작업할 때 Myelin 제거 비즈의 추가 사용 훨씬 더 효과적으로 표시됩니다.
Disclosures
Miltenyi Biotec 저자 GmbH를, 독일의 직원입니다.
Materials
References
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