Summary
Photoswitching Intravital ומעקב אחר Dendra2 שכותרתו תאים סרטניים דרך החלון הדמיה החלב היא טכניקה המאפשרת לנו תמונת התנהגות גרורתי של תאים סרטניים microenvironments הגידול נבחר על זמנים של ימים.
Abstract
בעשור האחרון, מיקרוסקופיה intravital של גידולים בשד אצל עכברים וחולדות ברזולוציה של תא בודד
Protocol
1. הדור של גידולים פלורסנט באמצעות הזרקה של תאים סרטניים לתוך כרית שומן החלב:
- לגדול קו תא להביע Dendra2 חלבון (כסמן cytoplasmic) ל 40 - 80% confluency.
- לשטוף כלים לפחות 3 פעמים עם Ca PBS w / o או 2 + Mg 2 +.
- הוסף 3 מ"ל של טריפסין לכל צלחת 10 ס"מ לדגור על 37 מעלות צלזיוס עד שרוב התאים לנתק ולאחר מכן פגע את המנה כנגד משטח שטוח כדי ללחוץ אותה.
- יש לשטוף את כל התאים את המנה, ולהשתמש מגרד (שוטר גומי) כדי לאסוף מטריקס גם כן. מוסיפים 5 מ"ל של PBS. קח aliquot לספור במהלך צנטריפוגה.
- צנטריפוגה ב 800 גרם במשך 5 דקות.
- לשאוב ו resuspend ב PBS לריכוז של 5 - 10 מ"ל 10x / 6. חנות על הקרח עד מוזרק (להזריק בתוך 30 דקות).
- המקום כלוב ובו 4-5 הישן בשבוע נקבות עכברים חסר החיסונית (למשל SCID) בתוך ברדס סטרילית.
- תרסיס האזור סביב הפטמה (בטן) 4 עם 70% אתנול.
- להזריק 0.1 מ"ל לתוך כרית שומן החלב. אם עוזר, ניתן למצוא, אדם אחד יכול להחזיק את העכבר במקום ואילו השני מוסיף את המחט בתוך כרית שומן החלב. אם אתה הזרקת בעצמך, לשים את העכבר תחת הרדמה קלה באמצעות isoflurane.
- לאחר הגידול גדל 5-7 מ"מ, חלון הדמיה החלב (MIW) צריך להיות מוכנס.
הערה: לחלופין, עבור יישומים מסוימים, MIW יכול להיות מוכנס על גבי משטח בריא שומן החלב ואת התאים ניתן להזריק לאחר מכן. גישה זו מאפשרת הדמיה של תאים transfected transiently בסביבה פיזיולוגיים.
2. ייצור ידני של חלון ההדמיה החלב (MIW):
- MIWs (איור 1A) עשויים פלסטיק כיתה רקמה כדי להבטיח biocompatibility. עבור בנייה ידנית, אנו משתמשים 5 או 10 מנות ס"מ.
- לשים כפפות גומי על.
- מחממים את תבשיל רקמות תרבות creat משטח מעוקל על ידי דחיפת חפץ מעוגל, קשה נגד צלחת מחוממת (אנחנו משתמשים קצת 1 אינץ' dremmel בשביל זה).
- גזור את מרכז הצלחת באמצעות סכין גילוח מחומם.
- השתמש בצורת חרוט קטן, קצת dremmel לעשות חור במרכז הבסיס כיפה בצורת פלסטיק (6-7mm בקוטר).
- הפוך את הקצוות של בסיס פלסטיק חלקה לחלוטין על ידי מלטש את זה עם dremmel ובהמשך הגשת אותו.
- קובץ העליון של בסיס פלסטיק ביצוע משטח שטוח coverslip הזכוכית. הקוטר של פני השטח, הגיש שטוח צריך להיות 9-10mm.
- דבק 8mm בחוזר זכוכית coverslip (מספר 1) על משטח שטוח בעזרת דבק מגע (דבק cyanoacrylate).
- חכו הדבק להתייבש (15 דקות).
- שימוש במחט 26G מחומם כדי להפוך שמונה חורים תפירת ניקוב מבחוץ (שם הזכוכית) לחלק הפנימי של הבסיס. חורים צריך להיות מופץ באופן שווה סביב coverslip, 0.5-1 מ"מ מהקצה של coverslip.
- הרחבת חורים באמצעות מחט תפירת 5-0.
- ניקוב חורים בסיס פלסטיק תהפוך את פני השטח הפנימי אחידה. שימוש בנייר חול, להפוך חלק משטח זה לחלוטין.
- שנה את כפפות מברשת של חלקיקי פלסטיק קטנים מ MIW באמצעות מברשת קטנה.
- שטפו את MIW עם מים deionized.
- שטפו את MIW באמצעות אתנול 70%. השתמש Q-טיפ כדי לנקות את הזכוכית כך שקוף לחלוטין. אם יש כתמים מעורפל מתנה אדי דבק, אצטון להשתמש בזהירות עם Q-קצה.
- לעקר את MIW כתוצאה מחשיפה UV במשך 3 שעות בכל צד.
חצי ידני ייצור של חלון ההדמיה החלב (MIW):
על מנת לייצר את בסיס פלסטיק, אנחנו כרגע באמצעות גומי סיליקון תבניות יציקה שנוצרו באמצעות בעבודת יד MIWs. התבנית מורכבת משני חלקים של גומי סיליקון שהופכות העתק מדויק של חזית והן האחורי של המקור כאשר מלא עם שרף פוליאסטר ולאחר מכן הצטרף מיד יחד. שרף פוליאסטר נוזלי מעורבבים יחד 09:10 והתוצאות במבנה הקשיח כאשר נרפא באופן מלא 48h. פלסטיק הוא מוגן UV ארכיוני ללא פירוק או להפוך צהוב לאורך זמן.
אחרי הבסיס הוא נרפא, צעדים 2.8-2.16 נעשים באותו אופן כמו עבור MIWs ידני מתוצרת.
3. החדרת MIW:
- האזור סביב הפטמה 4 ה צריך (בקוטר של 5-7 מ"מ) קטן הגידול מספר ימים / שבועות לאחר הזרקה של תאים סרטניים, תלוי בסוג התא (איור 1B). כמה זמן עבר לאחר הזרקה של תאים לבטא Dendra2 חלבון photoswitchable או חלבוני ניאון אחרים תלוי בקו תא בשימוש. הגידול לא צריך להיות נמקי בעליל, ויש להם עור שלם עם שיער על החלק העליון של הגידול. עכברים עם גידולים נמקי צריך להיות מורדמים.
- הכנת שטח סטרילי עבור הניתוח, נשכב פיסת בד סטרילי בתוך ברדס סטרילית. שים חתיכת גרם סטריליתauze באמצע, ולהניח MIWs כמה מכשירים סטרילי סביבו: אנו משתמשים במספריים תקן קטן, מספריים האביב, microdissecting פינצטה, מלקחיים microdissecting, מחזיק מחט. שמור סטרילי Q-טיפים, בקבוק של אתנול 70% וכפפות סטריליות בפינה של מכסה המנוע.
- העכבר הוא הרדים בשכונה סטרילי באמצעות הזרקת ה-IP של Avertin 2.5% (20 μl / g) ב HBSS או לחילופין 10 מיקרוגרם / ק"ג קטמין + 10 מיקרוגרם / g xylazine (טיפול בבעלי חיים קשר שלך מכון הזמנת אישורים).
הערה: פתרון Avertin יש להכין דו שבועי, מסנן עיקור באמצעות 0.22 מיקרומטר לסנן המאוחסנים 500 aliquots μl בשעה 4 ° C (בחושך). - הסרת שיער באמצעות גילוח האזור שמעל הגידול באמצעות גילוח חיה קטנה.
- הסר את שאר השיער באמצעות קרם להסרת שיער נאיר (זמין בכל בית מרקחת). נקו את העור באמצעות אתנול, טבל Q-טיפים.
- מעבירים את החיה על גבי גזה סטרילית להחיל משחת עיניים לעיניים כדי לשמור עליהם מפני התייבשות וזיהום.
- לחטא את העור בבטאדין ונקי עם אתנול 70%.
- מעבירים את החיה על בד כירורגי סטרילי בתוך מכסה המנוע סטרילית.
- משוך את העור המדיאלי מיד הפטמה באמצעות מלקחיים ולחתוך ~ 2mm חתך בעור.
- הפרד את כרית הבסיסית שומן החלב מהעור באמצעות מספריים לנתיחה ו מלקחיים. העור ולמתוח חור במהלך שלב זה הפרדה לגודל זה יהיה להתאים החדרת MIW.
- אם בטעות כלי נפגע במהלך sugery, השתמש סטרילי Q-טיפים כדי להסיר כל הדם מיוצר / לעצור את הדימום מלהפוך מוגזמת.
- הכנס את MIW כזה שיש העור על גבי בסיס MIW ו תפר במקום שימוש בלתי נספגים הפוך חיתוך חוט ומחט.
- השתמש דבק רקמות או cyanoacrylate למלא את החורים תפירת ולאבטח את MIW לעור.
- הוסף TMP-SMX לערבב אנטיביוטיקה: (Sulfamethoxazole 0.6 מ"ג / מ"ל, וטרימטופרים 0.12 מ"ג / מ"ל) לתוך הבקבוק את הכלוב במים במשך 3 ימים לפני ואחרי הניתוח.
- חיים נשאר תחת הרדמה עבור 1-4H לאחר ההזרקה IP Avertin. מאז הניתוח בדרך כלל לוקח ~ 45min, חשוב לעזור החיה להתאושש לאחר מכן:
- הניחו כרית חימום יד (37 ° C) (זמין בתי מרקחת) בחלק התחתון של הכלוב ולכסות אותו עם גזה.
- שמור על בעלי חיים על גבי כרית עד שהוא הופך על הבטן שלה ומתחיל ללכת.
- אם בעל החיים מחוסר הכרה במשך יותר מ 3h, להזריק 0.3 מ"ל של intraperitoneally HBSS עבור להחזרת נוזלים.
- החיה מותר להתאושש במשך 3-4 ימים לפני הפגישה הבאה הדמיה הראשונה נעשית.
4. הדמיה בנייה Box
תיבת הדמיה מבטיח כי MIW יושב שטוח, בדיוק מעל המטרה מיקרוסקופ. זה גם מקל על בקרת טמפרטורה הרדמה באמצעות זרימת אוויר מתמדת של isoflurane. התיבה עשויה פרספקס והדביק יחד באמצעות ריתוך פלסטיק. הוא מצויד לשלב מיקרוסקופ ספציפי ולכן את הצורה של התחתון שלה משתנה בהתאם המיקרוסקופ משמש (איור 2 מציג את התוכנית של תיבת מצויד לשלב מיקרוסקופ Leica SP5).
מידות של תיבת בסנטימטרים הם l = 11.4 ס"מ, w = 7.6 ס"מ, h = 4.4 ס"מ (איור 2 א). התחתון של התיבה מורכבת צלחת חלול, 12.7x8.4 ס"מ, אשר משתלב בתוך הבמה מיקרוסקופ Leica SP5, ושני הזזה "הדלתות", 5.7 X 5.7 cm_each, המהווים פתח עגול (d = 2.22 ס"מ ) כאשר סגורה. MIW נכנס לתוך פתח זה. החלק הקדמי מכיל את חור כניסת עבור משלוח תוך הרדמה אחת היצירות צד מכיל חור היציאה שמוביל הריק.
שים לב כי הקבל בעל שקופיות צורך להסיר לפני הצבת תיבת הדמיה.
5. תיבת הדמיה שימוש
- מניחים את החיה תחת הרדמה עם isoflurane וליישם משחה עיניים לעיניים.
- צרף את הפליטה isoflurane ממכונת הרדמה לחזית תיבת הדמיה, בצד החיצוני של החור מפרצון (תרשים 2B).
- צרף הצינור השני החור לשקע של תיבת הדמיה. צינור זה אמור להיות מצורף מסנן גז ואז הריק.
- פתח את מכסה הקופסה לפתוח את הדלתות תיבת והמקום בעלי חיים, לצד MIW מול התחתונה, דלתות הזזה לתוך הקופסה.
- החזק את תיבת ולהתאים את דלתות התחתונה כך בסיס MIW מוחזק, מנוטרל ביניהן. הבסיס MIW צריך להיות באותה רמה כמו הדלתות תיבת הדמיה, בעוד coverslip MIW יש רק כמה מילימטרים מתחת לרמה זו. ודא כי המיקום של MIW בין לתחתית דלתות הזזה מבטיח כי coverslip (חלק הזכוכית של MIW) שטוח, מקביל דלתות לתחתית הקופסה. זה יבטיח התמקדות נכונה.
- מנמיכים את המטרה מיקרוסקופ, על מנת לאפשר שטח עבור מיקום של תיבת עלמעל הבמה מיקרוסקופ.
- מניחים את הקופסה על הבמה מיקרוסקופ, ולהתאים את הבמה כך coverslip MIW מעל המטרה.
- פוקוס המטרה ולהתחיל הדמיה.
- בעת השימוש isoflurane, החיה צריכה להיות במעקב על ידי בדיקה ויזואלית של תדירות הנשימה. ניתן לעשות זאת מבחינה ויזואלית, או על ידי ניטור התדירות של חפצים נשימה המופיעים במהלך ההדמיה אוסף (אלה יכולים להפריע רכישת נתונים). המערכת הדופק MouseOx oximetry (סטאר מדעי החיים קורפ) שימש בהצלחה. בדרך זו הנתונים אפשר לאסוף ברציפות מבלי להפוך את האורות בחדר כדי לבדוק את החיה.
הערה: לאחר כל פגישה הדמיה, התאוששות חיה יש בהנחייתם של גלישת יד קטנה כרית חימום ב גזה או kimwipes ולשים אותו תחת החיה בכלוב.
הערה: אם אובייקטיבית טבילה משמש התמונה דרך MIW, המדיום טבילה (גליצרול מים, שמן) יש לנקות את חלון ההדמיה. MIW יש לבדוק עבור כל סדקים או נזק אחר שעלול להתרחש במהלך ההדמיה. זה קריטי עבור איסוף נתונים במהלך הפגישות הדמיה מרובים.
6. Photoswitching הדמיה של Dendra2 שכותרתו תאים
ההליך המתואר עבור המיקרוסקופ Leica SP5 confocal; הכוח לייזר המטוס מוקד, מטרות זמין ואפשרויות תוכנה להשתנות כאשר באמצעות מיקרוסקופים confocal אחרים או הדמיה multiphoton להגדיר, ולכן הפרוטוקול המתואר להלן אמור לשמש כמדריך כדי לייעל את הניסוי על מיקרוסקופ שלך.
- על ידי התבוננות הגידול דרך העינית (10x) עם מסנן הקרינה ירוק, לאתר כלי הדם הגדולים אשר נראה לעין זורם הנחת שטוח במישור מוקד זהה.
- אחד הכלים במרכז השדה ולעבור PMT זיהוי מיקום.
- הגדרת אוסף הדמיה רציפים עבור שני הערוצים. אחד הערוצים משתמש 488nm קו לייזר (10% כוח), ואוסף פיזור של תאי מטריקס (480-495nm) ופליטה מטופס הירוק של Dendra2 (505-540nm). האפיק השני משתמשת קו לייזר 543nm (90% כוח) ואוסף פליטת מטופס האדום של Dendra2 (555-600nm). איסוף תמונות 3D מראש photoswitching.
- השתמש באפשרות לסרוק את ההחזר על ההשקעה photoswitch אוכלוסייה נבחר של תאים באמצעות קו לייזר 405nm (30% כוח, סריקות 20-40). איסוף פליטה של הטופס אדום של החלבון כדי לפקח על המעבר.
- שימוש שגרתי רציפים זהה 6.3, לאסוף שלאחר החלפת תמונות 3D.
- אם photoswitching יותר אזור הגידול, מומלץ לצלם דרך oculars שימוש במצלמה דיגיטלית, הן בערוצים ירוק ואדום (איור 3 א, ב). זה יעזור בכיוון במהלך המפגשים הדמיה הבאים.
הערה: בנוסף, כלי הדם יכול להיות מתויג באופן זמני באמצעות הזרקה לווריד הזנב של הניאון dextran (אשד כחול או אלקסה פלואוריד 647, שניהם 10kDa). כמה שעות לאחר ההזרקה, dextrans יעזבו את כלי הדם לצמיתות התווית מקרופאגים.
נציג תוצאות:
איור 3C מראה אזור photoswitched מלבני (אדום) בכיוון orthogonally יחסית כלי הדם (אין פלואורסצנטי). Non-photoswitched תאים ירוקים, תוך פיזור בין המטריצה תאיים הוא סגול. תמונה היא הקרנת העוצמה המרבית של ארבע תמונות לאורך ציר Z-(20-50 מיקרומטר עומק).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי משרד ההגנה האמריקאי (BC075554 לב"ג ו BC061403 אל DK), ארה"ב National Institutes of Health (U54GM064346 כדי JvR; CA100324 אל JC, ג'ס ואת ג"ו; CA77522 כדי ג'ס, U54CA126511 אל JC ו BG). אנו מודים ד Entenberg לעזרה עם מיקרוסקופיה, מ Rottenkolber לעזרה בייצור של תיבת הדמיה ג'יי פולארד (אלברט איינשטיין קולג 'לרפואה) עבור נוגדן F4/80.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS w/o Ca, Mg | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| Trypsin | GIBCO, by Life Technologies | 25300 | |
| HBSS | GIBCO, by Life Technologies | 14025 | |
| DMEM media (MDA-MB-231 cells) | GIBCO, by Life Technologies | 11965 | |
| Isoflurane(Aerrane) | Baxter Internationl Inc. | # NDC 10019-773-40 | |
| SCID mouse | National Cancer Institute | N/A | |
| Culture dishes | BD Biosciences | 353003 | Custom Order |
| Circular coverslip 8 mm | Scientific, Inc. | 8CIR-1-FIS |
References
- Farina, K. L., Wyckoff, J. B., Rivera, J., Lee, H., Segall, J. E., Condeelis, J. S., Jones, J. G. Cell motility of tumor cells visualized in living intact primary tumors using green fluorescent protein. Cancer Res. 58, 2528-2532 (1998).
- Naumov, G. N., Wilson, S. M., MacDonald, I., Schmidt, E. E., Morris, V. L., Groom, A. C., Hoffman, R. M., Chambers, A. F. Cellular expression of green fluorescent protein, coupled with high-resolution in vivo videomicroscopy, to monitor steps in tumor metastasis. J Cell Sci. 112, 1835-1842 (1999).
- Brown, E. B. In vivo measurement of gene expression, angiogenesis and physiological function in tumors using multiphoton laser scanning microscopy. Nature Med. 7, 864-868 (2001).
- Wang, W., Wyckoff, J. B., Frohlich, V. C., Oleynikov, Y., Huttelmaier, S., Zavadil, J., Cermak, L., Bottinger, E. P., Singer, R. H., White, J. G., Segall, J. E., Condeelis, J. S. Single cell behavior in metastatic primary mammary tumors correlated with gene expression patterns revealed by molecular profiling. Cancer Res. 62, 6278-6288 (2002).
- Sidani, M., Wyckoff, J., Xue, C., Segall, J. E., Condeelis, J. Probing the microenvironment of mammary tumors using multiphoton microscopy. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 11, 151-163 (2006).
- Wyckoff, J. B., Wang, Y., Lin, E. Y., Li, J. F., Goswami, S., Stanley, E. R., Segall, J. E., Pollard, J. W., Condeelis, J. Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors. Cancer Res. 67, 2649-2656 (2007).
- Egeblad, M., Ewald, A. J., Askautrud, H. A., Truitt, M. L., Welm, B. E., Bainbridge, E., Peeters, G., Krummel, M. F., Werb, Z. Visualizing stromal cell dynamics in different tumor microenvironments by spinning disk confocal microscopy. Dis Model Mech. 1, 155-167 (2008).
- Mempel, T. R., Henrickson, S. E., von Adrian, U. T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases. Nature. 427, 154-159 (2004).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 2604-2609 (2003).
- Kedrin, D., Gligorijevic, B., Wyckoff, J., Verkhusha, V. V., Condeelis, J., Segall, J. E., van Rheenen, J. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nat. Methods. 5, 1019-1021 (2008).
- Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2. Nat. Protocols. 2, 2024-2032 (2007).
