Summary
이 동영상은 복부 대동맥의 infrarenal 세그먼트에 돼지의 췌장의 엘라스타제의 과도 intraluminal 주입을 통해 생쥐의 복부 대동맥 동맥류 (AAA)을 유도하는 방법을 보여줍니다. 모델은 다수의 유전자 변형과 유전자 녹아웃 마우스의 출현으로 인해 AAA의 pathobiology에 광범위한 통찰력을 추가할 수 있습니다.
Abstract
복부 대동맥의 infrarenal 세그먼트에 돼지의의 췌장 엘라스타제의 과도 intraluminal 주입은 처음 Anidjar 및 동료에 의해 쥐에서 설명한 이래 복부 대동맥 동맥류 (AAA)의 가장 널리 사용되는 동물 모델이다. 개발 1 근거 기반되었습니다 엘라스틴의 중단 성격에 AAAs에서 관찰했다. 이 쥐 모델은 마우스의 infrarenal 대동맥 지역에 AAAs을 생산하도록 수정되었습니다. 2 모델은 많은 유전자 변형과 유전자 녹아웃 마우스의 출현으로 인해 AAA의 pathobiology에 광범위한 통찰력을 추가할 수 있습니다. 또한, 그것은 AAA를위한 잠재적인 치료 대리인을 테스트하기 위해 가능한 플랫폼입니다. 이 비디오에서는, 우리는 실험실에서 사용되는 엘라스타제 주입 AAA 절차를 보여줍니다.
마우스는 isoflurane 2.5 %를 사용하여 anesthetized하고 있으며, 개복술은 멸균 조건하에 수행됩니다. 복부 aortais은 운영 stereomicroscope (Leica)의 도움을 고립. 근위 및 말초 대동맥 주위 임시 ligatures를 삽입 후, aortotomy는 30 게이지 바늘의 끝에있는 분기점에서 생성됩니다. PE - 10 폴리에틸렌 튜브의 열 테이퍼 세그먼트는 aortotomy를 통해 소개하고 안전합니다. 대동맥 루멘은 이후 생리가 포함된 형식의 I 돼지의 췌장 엘라스타제 (; 시그마 화학 (주) 4.5 U / ML)와 100mm의 HG에서 5~15분에 대한 perfused입니다. 재관류의 카테터 제거 후 aortotomy는 루멘의 수축하지 않고 수리합니다.
Protocol
- 마우스는 흡입 isoflurane 2.0 - 3.0ml / L. 함께 anesthetized 아르
- 복부는 면도와 알코올 및 betadine로 청소합니다.
- 마우스는 수술 분야에 부정사 배치됩니다.
- 멸균 장갑은 외과의에 의해 착용하고 있으며, 사용되는 악기는 뜨거운 비드 살균기로 소독하고 있습니다.
- 긴 정중선 복부 절개가 이루어집니다. 복부 내용은 복부 대동맥을 노출 멸균 거즈로 복부 외부 철회 있습니다.
- 복부 대동맥이 좌측 신장 정맥의 수준에서 분기점으로 격리됩니다.
- 복부 대동맥의 지점은 노출과 10-0 봉합과 출혈도 잡았 있습니다. 분기점의 1.0cm 이내에 모든 대동맥 지점은 출혈도 잡았 있습니다.
- 임시 6.0 실크 ligatures는 대동맥의 근위 및 말초 부분 주위에 배치됩니다
- aortotomy는 30 게이지 바늘로 분기점에서 생성됩니다.
- 열 테이퍼 폴리에틸렌 튜브 (PE - 10)은 aortotomy를 통해 소개하고 넥타이와 보안이다.
- 생리 가방을 사용하면 100 mmHg을 교정하기 위해 136cm의 높이에 걸려, 대동맥은 4.5 U / ML 타입 I 돼지의 췌장의 엘라스타제을 포함하고있는 식염수에 가득 차 있습니다. 대동맥은 일반적으로 5-15분의 엘라스타제 재관류 동안 원래 직경 150-170%에 열립니다.
- 재관류의 카테 테르는 다음 제거 aortotomy이 수축을 피하기 위해 10-0 봉합사와 함께 닫힙니다.
- aortotomy가 폐쇄되면 말초 묶인가 제거됩니다.
- 수리 aortotomy에서 거의 또는 전혀 출혈이있다면, 근위 묶인가 제거됩니다. 확대 대동맥는 즉시 피를 채웁니다.
- 창자는 복부에 반환하고, 상처는 6-0 나일론 / 폴리 프로필렌 봉합사와 두 레이어에 닫힙니다.
- 0.25 % Bupivicaime 방울 (appx 절개 크기의 각 센티미터 한 방울)이 Caprofen의 상처 하나 복용량에 표시됩니다 (5mg/kg) subcutaneously 주어집니다.
- 마우스가 따뜻한 지역에 위치하고 일반적으로 15 분 이내에 복구됩니다.
그림 1. 엘라스타제 유도 AAA 대표 결과.
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Discussion
이전 연구는 다른 상업 엘라스타제 준비 3 AAA 개발에 중요한 많은 - 투 - 많은 변화를 언급했습니다. 그러므로, 그것은 생산을 많이 모니터뿐만 아니라 AAAs를 유도하기 위해 준비의 능력을 문서화하기 위해 적절한 제어 그룹을 가지고 중요합니다.
흥미롭게도,이 모델에서 AAA 개발에 자화율 3를 사용하여 마우스 변형에 따라 좌우됩니다. 현재 비디오에 사용되는 마우스는 설명된 프로토콜을 사용 AAA의 지속적인 발전을 가지고 C57Bl / 6 변형입니다. 엘라스타제 농도 및 / 또는 부화 시간은 다른 계통을 수용할 수 있도록 조정할 수 있습니다.
생쥐의 엘라스타제와 AAA의 창조의 기술이 기술적으로 도전이지만, 그것은 AAA 형성과 발전의 기본 분자 메커니즘을 연구를위한 중요한 기술이다. 연습 및 기술 개조 우리 연구실에 90 % 이상의 성공률 결과있다. 우리는 비디오와 함께 텍스트이 기술을 사용하고자하는 연구소에 대한 학습 곡선을 줄이는 데 도움이 될 것입니다.
문제 해결
- 복부 대동맥의 가지 때문에 누출의 엘라스타제 주입하는 동안 운영 및 부족한 확장하는 동안 출혈을 방지, 10-0 봉합과 출혈도 잡았해야합니다.
- 명확하고 광대한 작동 필드를 가지고하는 것이 중요합니다. 따라서, 일시적으로 대동맥을 막다에 6-0 봉합사 대신 클램프를 사용하여
- 복부 대동맥의 루멘은 수술 후 혈전증을 방지하기 위해 생리 식염수로 삭제해야합니다.
- 그것은 테이퍼 PE - 10 튜브 더위의 끝이 삽입되면 내피 레이어를 긁적 방지하기 위해 부드럽게해야하는 것이 중요합니다.
- aortotomy 닫을 때 엘라스타제뿐만 아니라을 일으키는 경우 혈관 내부의 공기 방울은 피해야한다.
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Acknowledgments
국립 보건원에서 (P50 HL083800 - 03) :이 작품은 SCCOR 부여 "메커니즘, 충화, 그리고 치료 AAA 질병"을 지원했습니다
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Type I porcine pancreatic elastase | Reagent | Sigma-Aldrich | E1250 | |
| polyethylene tubing (PE-10) | BD Biosciences | 427400 | ||
| CHANGE-A-TIP | Bovie Medical Corporation | 18010-00 (FST) | cautery knife | |
| LEICA MZ6 | Leica Microsystems | stereomicroscope | ||
| LEICA DFC290HD | Leica Microsystems | USB camera | ||
| Image Pro Express ver. 6.0 | Media Cybernetics Inc. | software |
References
- Anidjar, S., Salzmann, J. L., Gentric, D. Elastase-induced experimental aneurysms in rats. Circulation. 82 (3), 973-973 (1990).
- Pyo, R., Lee, J. K., Shipley, J. M. Targeted gene disruption of matrix metalloproteinase-9 (gelatinase B) suppresses development of experimental abdominal aortic aneurysms. J Clin Invest. 105 (11), 1641-1641 (2000).
- Carsten, C. G. 3rd, Calton, W. C., Johanning, J. M. Elastase is not sufficient to induce experimental abdominal aortic aneurysms. J Vasc Surg. 33 (6), 1255-1255 (2001).
