Summary
Надпочечников медуллярного хромаффинных системах клеточных культур являются чрезвычайно полезными для изучения возбуждения секреции связи в в создании пробирке. Этот протокол иллюстрирует метод, используемый для рассекать надпочечников, а затем изолировать медуллярного регионе избавлением от коры надпочечников. Переваривание мозга в одиночных камерах хромаффинных затем продемонстрирована.
Abstract
Надпочечников медуллярного хромаффинных системах клеточных культур являются чрезвычайно полезными для изучения возбуждения секреции связи в в создании пробирке. Этот протокол иллюстрирует метод, используемый для рассекать надпочечников, а затем изолировать медуллярного регионе избавлением от коры надпочечников. Переваривание мозга в одиночных камерах хромаффинных затем продемонстрирована.
Protocol
Сокращения:
РДЦ - надпочечников хромаффинных клеток, Е. Soln - раствор фермента, Е. DMEM - Обогащенный Дульбеко изменения Eagle среднего
- Подготовка
- Добавить папаин, чтобы желаемое количество E. Soln (40 единиц папаин / 1 мл Е. Soln.).
- Активировать папаин с карбогена в течение приблизительно 15 минут на льду. Кислородом Локка буфера на льду, а также.
- Рассечение
- Используйте 8-10 недель мыши.
- До пищеварения удалить кислородом буфера Локка и место на льду.
- Смотрите видео для вскрытия процедуры.
- Как только вырезали, место желез кислородом буфера Локка.
- Подготовка железы
- Удаление жира из железа.
- Газа коры из железа.
- Ферментативного пищеварения
- Стерильный фильтр кислородом папаин.
- Сделайте четыре бассейна кислородом папаин на чашке Петри.
- 3 бассейна должна быть около 100uls.
- 1 из бассейнов должна быть около 400uls.
- Вымойте medullae через бассейны
- С 1 по 3 100 мкл бассейнов.
- Затем через 400ul бассейн
- Pippette 300ul Е. Soln и мозгового вещества отрывки из 400ul бассейн в микроцентрифужную трубки.
- Qrap парафильмом и отцентрифугировать трубки и места в 37 ° С на водяной бане 20 минут.
- Помните продолжать кислородом оставшиеся Е. Soln содержащие папаин.
- Через 20 минут стерильный фильтр более Е. Soln.
- Замените старые Е. Soln купания medullae с вновь фильтруются Е. Soln.
- Triturations
- Аспирацию и отбросить Е. Soln.
- Вымойте medullae в 1 мл Е. DMEM.
- Аспирацию и отбросить Е. DMEM.
- Добавить 300ul Е. DMEM и растирают с 20-кратным 1мл чаевые.
- Вырезать 200ul кончик стерильным лезвием бритвы.
- Измельченного в порошок 5-10X с вырезом наконечник 200ul.
- Отменить Е. DMEM части купания medullae. Средний будет содержать мусор.
- Добавить 300uls свежие Е. DMEM к medullae штук.
- Растирают с 200ul наконечник 20x
- Pippette Е. DMEM к микроцентрифужную трубки withough medullae штук. Средний будет содержать свободный РДЦ.
- Добавить 300uls свежие Е. DMEM к medullae штук.
- Измельченного в порошок medullae с 23,5 калибр иглы шприца 20x.
- Комбинат Е. DMEM с обеих triturations. Medullae частей не должна присутствовать и должны теперь иметь featherlike внешний вид.
- Обшивка
- Микроцентрифужную Е. DMEM из последних двух растиранием шаги по 2,5 минуты на 3.7g s.
- Ресуспендируют пеллет в 50uls-200 Е. DMEM, в зависимости от последующих экспериментах.
- Пластина 10-30uls на покровное стекло.
- Подождите 15 минут для клеток придерживаться.
- Добавить 750uls Е. DMEM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.