Biology

خلية فأر أليف للكروم عزل الكظرية

Published: January 5, 2007 doi: 10.3791/129

Aaron Kolski-Andreaco¹, Haijiang Cai^2,3, D. Spencer Currle⁴, K. George Chandy¹, Robert H. Chow^2,3

¹Department of Physiology and Biophysics, University of California, Irvine (UCI), ²Department of Physiology and Biophysics, University of Southern California, Keck School of Medicine, ³Zilkha Neurogenetic Institute, University of Southern California, Keck School of Medicine, ⁴Department of Developmental and Cell Biology, University of California, Irvine (UCI)

Summary

نظم أليف للكروم الكظرية خلية ثقافة النخاعية مفيدة للغاية لدراسة الإثارة ، في إفراز اقتران في وضع المختبر. هذا البروتوكول يوضح الطريقة التي استخدمت لتشريح الغدة الكظرية ثم عزل المنطقة النخاعية بتجريد بعيدا القشرة الكظرية. ويتجلى ذلك في الهضم من النخاع إلى خلايا أليفة الكروم واحد.

Abstract

Protocol

الاختصارات :
لجنة التنسيق الإدارية -- الكظرية خلايا أليفة الكروم ، E. Soln -- محلول أنزيم ، E. DMEM -- Dulbecco اليورانيوم في التعديل النسر متوسطة

إعداد
1. إضافة إلى كمية غراء المرجوة من Soln E. (40 وحدة غراء / 1ml Soln هاء).
2. تنشيط غراء مع كربوجين لمدة 15 دقيقة على الجليد. لوك الأوكسجين في المخزن على الجليد كذلك.
تشريح
1. استخدام الماوس 8-10 أسبوع.
2. قبل إزالة الهضم الاوكسيجين العازلة لوك ومكان على الجليد.
3. الرجوع الى الفيديو لإجراء تشريح.
4. الاوكسيجين في مكان الغدد رفعه مرة واحدة ، العازلة لوك.
إعداد الغدة
1. إزالة الدهون من الغدة.
2. الشريط القشرة من الغدة.
الأنزيمية الهضم
1. الاوكسيجين تصفية العقيمة غراء.
2. إعداد أربع برك من غراء الاوكسيجين على طبق بتري.
  1. وينبغي أن يكون حول 3 حمامات 100uls.
  2. 1 ينبغي أن يكون للحمامات حول 400uls.
3. تغسل من خلال تجمعات للنخاع
  1. 1 من خلال برك 3 100ul.
  2. ثم من خلال تجمع 400ul
  3. Pippette 300ul E. Soln والنخاع قطعة من تجمع 400ul في أنبوب microfuge.
  4. Qrap parafilm على أنبوب microfuge والمكان في 37 درجة مئوية حمام الماء ل20min.
  5. تذكر أن يواصل الأوكسجين Soln E. المتبقية التي تحتوي على غراء.
  6. بعد 20 دقيقة معقمة أكثر تصفية E. Soln.
  7. تحل محل القديمة الاستحمام Soln هاء هاء للنخاع مع Soln تصفيتها حديثا.
Triturations
1. نضح وتجاهل E. Soln.
2. غسل للنخاع في 1ml E. DMEM.
3. نضح وتجاهل E. DMEM.
4. إضافة 300ul E. DMEM ومتمزج 20X مع 1ml الحافة.
5. خفض الحافة 200ul مع شفرة حلاقة معقمة.
6. 5 - 10X متمزج مع تلميح 200ul قطع.
7. تجاهل E. نخاع قطع DMEM الاستحمام. وسوف تحتوي على الحطام المتوسطة.
8. إضافة 300uls الطازجة E. DMEM لنخاع القطع.
9. متمزج مع تلميح 200ul 20X
10. Pippette E. DMEM microfuge لقطع أنبوب withough للنخاع. وسوف تحتوي على لجنة التنسيق الإدارية المتوسطة الحرة.
11. إضافة 300uls الطازجة E. DMEM لنخاع القطع.
12. متمزج نخاع بإبرة حقنة قياس 23.5 20X.
13. الجمع بين هاء DMEM من كلا triturations. وينبغي قطع نخاع لا تكون موجودة ويجب أن يكون الآن في مظهر featherlike.
تصفيح
1. Microfuge E. DMEM من الخطوات الأخيرة سحن اثنان ل2.5 دقيقة في 3.7g ثانية.
2. Resuspend بيليه في 50uls - 200 DMEM E. ، اعتمادا على التجارب اللاحقة.
3. 10 لوحة 30uls ساترة على الزجاج.
4. انتظر 15 دقيقة لخلايا التمسك به.
5. إضافة 750uls من DMEM هاء.