Summary
부신 골수의 chromaffin 세포 배양 시스템은 체외 설정에의 자극 - 분비 커플링 연구를 위해 매우 유용합니다. 이 프로토콜은 adrenals을 해부하다 다음 부신 피질 멀리 벗겨진하여 골수의 영역을 분리하는 데 사용되는 방법을 보여줍니다. 단일 chromaffin 세포로 골수의 소화는 다음 증명됩니다.
Abstract
부신 골수의 chromaffin 세포 배양 시스템은 체외 설정에의 자극 - 분비 커플링 연구를 위해 매우 유용합니다. 이 프로토콜은 adrenals을 해부하다 다음 부신 피질 멀리 벗겨진하여 골수의 영역을 분리하는 데 사용되는 방법을 보여줍니다. 단일 chromaffin 세포로 골수의 소화는 다음 증명됩니다.
Protocol
약어 :
ACCs - 부신 Chromaffin 세포, E. Soln - 효소 솔루션, E. DMEM - 풍부한 Dulbecco의 수정된 이글 매체
- 준비
- E. Soln (40 단위 papain / 1ml E. Soln.) 중 원하는 수량에 papain을 추가합니다.
- 얼음 약 15 분 carbogen와 papain을 활성화합니다. 산소 로크의 얼음 버퍼뿐.
- 해부
- 80~10주 마우스를 사용합니다.
- 제거 소화하기 전에 로크의 버퍼와 얼음 장소 산소.
- 절개 절차에 대한 비디오를 참조하십시오.
- 일단 excised에서 장소 땀샘은 로크의 버퍼를 산소.
- 수유기의 준비
- 글랜드에서 지방 제거합니다.
- 글랜드에서 피질을 스트립.
- 효소 소화
- 무균 필터 papain을 산소.
- 배양 접시에 산소 papain 네 가지 풀을하십시오.
- 3 수영장 100uls에 대해해야합니다.
- 수영장의 1 400uls에 대해해야합니다.
- 풀을 통해 medullae 와시
- 3 100ul 수영장으로 첫번째.
- 다음 400ul 수영장을 통해
- microfuge 튜브에 400ul 수영장에서 Pippette 300ul E. Soln와 모수의 조각.
- 37 microfuge 튜브 및 장소에 Qrap parafilm ° C 20 분에 대한 물 목욕.
- papain을 포함한 산소 나머지 E. Soln 계속 잊지 마십시오.
- 후 이십분 살균 필터 더 E. Soln.
- 새로 필터링 E. Soln와 오래된 E. Soln의 입욕 medullae를 교체합니다.
- Triturations
- 기음과 E. Soln을 삭제.
- 1ml E. DMEM에 medullae 씻으십시오.
- 기음과 E. DMEM을 삭제.
- 1ml 팁과 300ul E. DMEM과 씹다 20X를 추가합니다.
- 무균 면도날로 200ul 팁 컷.
- 컷 200ul 팁 5 - 10X 씹다.
- E. DMEM의 입욕 medullae 조각을 폐기하십시오. 매체 파편이 포함됩니다.
- 조각 medullae하는 300uls 신선한 E. DMEM을 추가합니다.
- 200ul 팁 20x와 씹다
- Pippette E. DMEM는 튜브 withough medullae 조각을 microfuge 수 있습니다. 매체 무료 ACCs이 포함됩니다.
- 조각 medullae하는 300uls 신선한 E. DMEM을 추가합니다.
- 23.5 게이지 주사기 바늘 20x와 medullae를 씹다.
- 두 triturations에서 E. DMEM을 결합합니다. Medullae 조각은 존재하지 않아야 지금 featherlike 모습이 있어야합니다.
- 도금
- 3.7g S.에서 2.5 분 마지막 두 분쇄 단계에서 Microfuge E. DMEM
- 후속 실험에 따라 50uls - 200 E. DMEM에 Resuspend 펠릿.
- 플레이트 유리 coverslip 10 - 30uls.
- 준수하는 세포 15 분 동안 기다리십시오.
- E. DMEM의 750uls를 추가합니다.
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