Summary
Descrição de um vírus induzida silenciamento de genes método (VIGS) para knock-down da expressão gênica em
Abstract
Interferência de RNA (RNAi) é um fenômeno altamente específico gene silenciando-desencadeada por dsRNA 1. Este mecanismo de silenciamento usa duas classes principais de reguladores de RNA: microRNAs, que são produzidos a partir de proteínas não-genes que codificam e curto RNAs de interferência (siRNAs). As plantas usam RNAi para controle transposons e exercer um controlo apertado sobre os processos de desenvolvimento como a formação de órgãos florais e desenvolvimento de folhas 2,3,4. Plantas também usar RNAi para se defender contra a infecção por vírus. Conseqüentemente, muitos vírus evoluíram de silenciamento de genes supressores de permitir sua colonização bem sucedida de seu hospedeiro 5.
Induzida por vírus silenciamento gênico (VIGS) é um método que aproveita o mecanismo de defesa das plantas RNAi mediada antiviral. Em plantas infectadas com o vírus modificado o mecanismo é especificamente dirigidas contra o genoma viral. No entanto, com vetores de vírus carregando seqüências derivadas de genes do hospedeiro, o processo pode ser adicionalmente dirigidas contra o mRNAs de host correspondente. VIGS foi adaptado para high-throughput genômica funcional em plantas usando a planta patógeno Agrobacterium tumefaciens para oferecer, através da sua Ti plasmídeo, um vírus recombinante carregando toda ou parte da seqüência do gene alvo para silenciar. Propagação do vírus sistêmico e endógeno plantas RNAi máquinas cuidar do resto. dsRNAs correspondente ao gene-alvo são produzidas e depois clivado pela Dicer ribonuclease em siRNAs de 21 a 24 nucleotídeos de comprimento. Estes siRNAs em última análise, orientar a RNA induzida silenciamento complexos (RISC) para degradar a transcrição alvo 2.
Diferentes vetores têm sido empregadas em VIGS e um dos mais utilizados é baseado em tabaco rattle vírus (TRV). TRV é um vírus bipartido e, como tal, A. dois diferentes cepas tumefaciens são usados para VIGS. Um carrega pTRV1, que codifica as funções de replicação e movimento viral, enquanto o outro, pTRV2, abriga a capa protéica ea seqüência utilizada para VIGS 6,7. Nicotiana benthamiana inoculação de mudas de tomate e com uma mistura de ambas as linhagens resultados no silenciamento gênico. Silenciamento do gene endógeno fitoeno desaturase (PDS), que causa fotobranqueamento, é usado como um controle para a eficiência VIGS. Deve-se notar, no entanto, que o silenciamento em tomate é normalmente menos eficiente do que em N. benthamiana. RNA abundância transcrição do gene de interesse deve ser sempre medida para garantir que o gene-alvo tem sido eficiente para baixo-regulado. No entanto, seqüências de genes heterólogos a partir de N. benthamiana podem ser usadas para silenciar seus respectivos ortólogos no tomate e vice-versa 8.
Protocol
Parte 1: O material vegetal
N. benthamiana plantas usadas para silenciar deve ser em torno de 2 ½ semanas de idade que é o momento em que os cotilédones e os primeiros 2 - 4 folhas verdadeiras têm surgido. Tomate (Solanum lycopersicum) plantas são usadas 7-8 dias pós-emergência, quando as folhas verdade ainda não apareceu.
Parte 2: VIGS
DIA 1
- Para cada experimento, Agrobacterium tumefaciens abrigar pTRV1, pTRV2, pTRV2-PDS e pTRV2 host-gene-alvo são cultivadas em placas de LB ágar suplementado com 50 mg / mL de canamicina e 100 mcg / mL de rifampicina. A canamicina seleciona para o pTRV plasmídeo enquanto a rifampicina faz isso para a Agrobacterium. Incubar as placas a 30 ° C por 2 dias.
Silenciamento de PDS fará as plantas para photobleach e é usado como um controle de eficiência silenciar. Além disso, os genes para ser downregulated deve ser clonado em um vetor pTRV2. Há um Gateway compatível pTRV2 vector que pode facilitar a clonagem e é descrito por Liu et al. (2002).
DIA 3
- Inocular um 2-3 cultura mL de líquido LB com os antibióticos acima mencionados para cada uma das cepas. Incubar por agitação a 30 ° C por 16-18 horas e 200 rpm
DIA 4
- Inocular a 1: 25 de diluição da cultura primária em um secundário líquido Mídia indução (IM) cultura IM com canamicina, rifampicina e 200 acetosyringone mM (Tabelas 1, 2 e 3). O acetosyringone é usado como um indutor dos genes vir de Agrobacterium que são necessários para T-DNA pode transferir para a planta 9, enquanto o IM imita o ambiente que esse patógeno encontra no apoplasto host. Incubar por agitação a 30 ° C por 20 - 24 horas e 200 rpm
DIA 5
- Colher as células por centrifugating por 10 minutos a 3000 x g. Ressuspender no mesmo volume que a cultura original tinha com 10 mM MgCl 2, 10 mM MES pH 5,5. Células podem ser suavemente agitadas para ressuspender-los.
- Centrífuga as células novamente por 10 minutos a 3000 x g. Ressuspender em metade do volume da cultura original com 10 mM MgCl2, 10 mM MES pH 5,5.
- Prepare uma suspensão bacteriana com um OD 600 de 0,3 para cada cultura bacteriana. Adicionar acetosyringone para uma concentração final de 400 mM para a cultura pTRV1.
- Misture as culturas contendo o pTRV1 eo pTRV2 (ou o pTRV2 contendo o gene de interesse) em uma proporção de 1 para 1. Incluem também um controle pTRV2-PDS. Por favor, note que a concentração acetosyringone final é agora 200 mM e que cada cultura se encontra um OD 600 de 0,15.
- Rótulo as mudas a ser infiltrada com o gene a ser silenciadas e da data do experimento.
- Picar um furo em cada folha a ser infiltrada com uma agulha. Use uma seringa de 1 mL desnecessário para se infiltrar a suspensão bacteriana em mudas. Para tomate, infiltrar tanto cotilédones, enquanto para N. benthamiana, infiltrado maior das duas folhas verdadeiras. Cinco mL de cada mistura bacteriana deve ser suficiente para se infiltrar 15 N. benthamiana e 25 mudas de tomate. Evitar a contaminação cruzada, mudando de luvas entre infiltrações e por não regar as plantas até o dia seguinte após a inoculação.
- As plantas são mantidas em 20-22 ° C em câmara de crescimento com um comprimento dias 16 horas e 50% de UR por pelo menos 3 semanas e meia antes de poderem ser utilizados para os ensaios.
Parte 3: Os resultados representativos
A Figura 1 mostra um experimento representativo, com N. benthamiana e plantas de tomate silenciados para PDS. Plantas mostrar o fenótipo característico fotobranqueamento observada em plantas com quantidades diminuídas de carotenóides. Para o PDS-silenciados plantas controle, começa a fotodegradação de ser visto, logo que 1 ½ semanas após a infiltração.
Figura 1. Silenciamento do gene controle PDS causas fotobranqueamento em N. benthamiana (A) e (B) de tomate plantas. Fotografias foram tiradas três semanas e meia depois silenciar.
Tabela 1. Preparação de meio de indução (IM).
| 400 mL | H 2 O destilada |
| 4,88 g | MES (2 - (4 morfolino) etano-sulfônico) |
| 2,5 g | Glicose |
| 0,12 g | NaH 2 PO 4 |
Trazer para um volume final de 475 mL com dH 2 O e ajustar o pH para 5,6. Autoclave. Depois que o meio tem arrefecido, adicione 25 ml de 20X sais AB.
Tabela 2. Preparação de sais de AB.
| 20 g | NH 4 Cl |
| 6 g | MgSO 4 · 7H 2 O |
| 3 g | KCl |
| 0,2 g | CaCl 2 |
| 0,05 g | FeSO 4 · 7H 2 O |
Trazer para um volume final de 1 litro com água destilada. Autoclave. Esteja ciente de que os sais AB precipitar como um pó laranja. Apenas misture bem por agitação antes da sua utilização.
Tabela 3. Preparação de 200 Acetosyringone mM. Por favor note que acetosyringone deve ser preparado no dia em que será usado.
| 19,6 mg | Acetosyringone (3 ', 5'-dimetoxi-4'-hidroxiacetofonona) |
| 500 mL | DMSO (Dimetil sulfóxido) |
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Discussion
Induzida por vírus silenciamento do gene é um método que permite rápida reverter telas genética. Ele evita a geração de T-DNA ou gene mediada transposon knock-outs, que só estão disponíveis em certas plantas, como Arabidopsis e de milho. Ele também contorna o processo demorado de transformação de plantas e permite o direcionamento de múltiplos genes, ao mesmo tempo, desde que tenham 10 ou homologia suficiente que as seqüências alvo diferentes de acolhimento são dispostos em tandem no silenciamento vector 6, 11.
No entanto, silenciando nunca é 100% eficiente e, portanto, é preciso ter cuidado ao interpretar os resultados. Um resultado negativo pode simplesmente indicar que a concentração de proteína residual foi suficiente para realizar sua função sem óbvias conseqüências fenotípicas. Além disso, algumas construções são melhores em silenciamento do que outros por isso é sempre aconselhável a utilização de pelo menos duas regiões diferentes mRNA para gerar as construções silenciar para cada gene. Além disso, há sempre a possibilidade de fora do alvo silenciamento se há homologia suficiente de um gene com a sua construção silenciar ou se siRNAs secundário, que pode causar silenciar transitiva, são produzidos 12. Isto é especialmente verdade para as famílias de genes. Portanto, é de extrema importância para quantificar a eficiência silenciamento de seu alvo e fora do alvo genes, seja por RT-PCR ou análise de Northern blot. Se RT-PCR é escolhido como o método para estimar a eficiência VIGS, um dos primers deve anneal para o gene alvo fora da região para silenciar, para que a transcrição sendo produzido pelo vírus também não é amplificado e os resultados refletem verdadeiramente o dowregulation de um determinado gene endógeno.
Eficiência VIGS é sempre maior em N. benthamiana do que no tomate. Portanto, o cuidado deve ser tomado quando o silenciamento de mudas de tomate. Em tomate, é fundamental para escolher o estágio de desenvolvimento de plantas direito e manter condições adequadas de meio ambiente para a propagação viral. Além disso, a abundância transcrição de genes devem ser executadas para cada planta em estudo. Além disso, geralmente em VIGS de tomate, o A. tumefaciens cepa é GV3101 enquanto em N. benthamiana ou GV3101 GV2260 ou são utilizados 6,13. É possível silenciar um gene empregando uma seqüência heteróloga de outra espécie, desde que haja suficiente homologia entre os dois. Além disso, ao construir um vetor de genes pTRV2-alvo, comprimentos de inserção deve estar na faixa de 200 a 1000 bp e não devem incluir regiões homopolímero (por exemplo, poli A caudas) 14.
Se as culturas levando pTRV2 com os genes de interesse contaminados com PDS, às vezes não fotobranqueamento será observado. Em vez disso, as plantas terão uma estatura mais baixa. Portanto, é fundamental para minimizar quaisquer fontes de contaminação cruzada durante o experimento que poderia potencialmente viés seus resultados.
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Acknowledgments
Agradecemos ao Dr. Patricia Manosalva para seus insights valiosos sobre o manuscrito. O financiamento foi fornecido pelo National Science Foundation Programa Genoma Plant, número prêmio DBI-0605059.
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