Virale silenziamento genico (VIGS) in Nicotiana benthamiana E Pomodoro

Summary

Descrizione di un virus-indotto silenziamento genico (VIGS) metodo per knock-down di espressione genica in

Abstract

Interferenza dell'RNA (RNAi) è altamente specifico silenziamento genico fenomeno innescato da dsRNA ^1. Questo meccanismo di silenziamento utilizza due grandi classi di RNA regolatori: microRNA, che sono prodotte da geni che codificano proteine ​​e non breve RNA interferenti (siRNA). Le piante usano RNAi per controllare trasposoni e di esercitare uno stretto controllo sui processi di sviluppo come la formazione di organi di fiori e foglie sviluppo ^2,3,4. Piante anche usare RNAi per difendersi contro le infezioni da virus. Di conseguenza, molti virus si sono evoluti soppressori di silenziamento genico per consentire loro colonizzazione successo del loro ospite ^5.

Virale silenziamento genico (VIGS) è un metodo che sfrutta la RNAi mediato da meccanismi di difesa piante antivirali. In piante infette da virus modificato il meccanismo è specificamente mirate contro il genoma virale. Tuttavia, con vettori di virus che trasportano sequenze derivate da geni dell'organismo ospite, il processo può essere ulteriormente mirate contro il mRNA host corrispondente. VIGS è stato adattato per la genomica funzionale high-throughput nelle piante utilizzando il patogeno per le piante Agrobacterium tumefaciens per fornire, tramite il suo Ti plasmide, un virus ricombinante portando l'intero o parte della sequenza genica mirata per tacere. Diffusione del virus sistemico e il endogeno impianti RNAi macchinari prendersi cura del resto. dsRNAs corrispondente al gene bersaglio vengono prodotti e poi scisso dal Dicer ribonucleasi in siRNA del 21-24 nucleotidi di lunghezza. Queste siRNA in ultima analisi, guida l'RNA di silenziamento indotto complesso (RISC) a degradare la trascrizione obiettivo ^2.

Diversi vettori sono stati impiegati in VIGS e uno dei più frequentemente utilizzato è basato su tabacco sonaglio virus (TRV). TRV è un virus bipartito e, come tale, A. due diversi ceppi di Agrobacterium sono usati per VIGS. Si porta pTRV1, che codifica le funzioni di replicazione virale e il movimento, mentre l'altro, pTRV2, porti la proteina di rivestimento e la sequenza usata per VIGS ^6,7. Inoculazione di Nicotiana benthamiana e di piantine di pomodoro con un misto di entrambi i risultati ceppi di silenziamento genico. Silenziamento del endogeno phytoene desaturasi (PDS) del gene, che provoca photobleaching, viene utilizzato come controllo per l'efficienza VIGS. Va notato, tuttavia, che il silenziamento di pomodoro è generalmente meno efficiente rispetto a N. benthamiana. Abbondanza trascrizione dell'RNA del gene di interesse deve essere sempre misurata per garantire che il gene bersaglio è stato efficacemente down-regolato. Tuttavia, sequenze di geni eterologhi da N. benthamiana può essere utilizzato per mettere a tacere i rispettivi ortologhi di pomodoro e viceversa ^8.

Protocol

Parte 1: Materiale vegetale

N. benthamiana piante utilizzate per tacere dovrebbe essere intorno al 2 ½ settimane di vita che è il momento in cui i cotiledoni e le prime 2 - 4 foglie vere sono emerse. Pomodoro (Solanum lycopersicum) piante vengono utilizzate 7-8 giorni dopo l'emergenza, quando le foglie vere non sono ancora apparsi.

Parte 2: VIGS

GIORNO 1

1. Per ogni esperimento, Agrobacterium tumefaciens ospitare pTRV1, pTRV2, pTRV2-Pds e pTRV2-host gene bersaglio vengono coltivati ​​su piastre di agar LB integrata con 50 mg / ml di kanamicina e 100 mg / ml di rifampicina. La kanamicina seleziona per la pTRV plasmide mentre la rifampicina lo fa per l'Agrobacterium. Incubare la piastra a 30 ° C per 2 giorni.
   Silenziamento del PDS causerà le piante a photobleach ed è utilizzato come controllo di efficienza a tacere. Inoltre, i geni per essere inibiti deve essere clonato in un vettore pTRV2. C'è un gateway compatibile pTRV2 vettore che possono facilitare la clonazione ed è descritto da Liu et al. (2002).

3 ° GIORNO

1. Inoculare 2-3 ml di coltura liquida LB con gli antibiotici di cui sopra per ciascuno dei ceppi. Incubare agitando a 30 ° C per 16 - 18 ore e 200 giri al minuto

GIORNO 4

1. Inoculare 1: 25 diluizione della coltura principale in una media secondaria di induzione liquido (IM) cultura IM con kanamicina, rifampicina e 200 acetosyringone mM (Tabelle 1, 2 e 3). Il acetosyringone viene utilizzato come un induttore dei geni vir di Agrobacterium che sono necessarie per T-DNA trasferimento nella pianta ^9, mentre l'IM imita l'ambiente questo patogeno incontra nel apoplast ospitante. Incubare agitando a 30 ° C per 20 - 24 ore e 200 giri al minuto

GIORNO 5

1. Raccogliere le cellule per centrifugazione per 10 minuti a 3000 x g. Risospendere nello stesso volume che la cultura originale era con 10 mM MgCl _2, 10 mM MES pH 5,5. Cellule possono essere delicatamente in agitazione per sospendere di nuovo loro.
2. Centrifugue le cellule di nuovo per 10 minuti a 3000 x g. Risospendere in metà del volume della cultura di origine con 10 mM MgCl2, 10 mM MES pH 5,5.
3. Preparare una sospensione batterica con un diametro esterno ₆₀₀ di 0,3 per ogni coltura batterica. Aggiungi acetosyringone ad una concentrazione finale di 400 mM alla cultura pTRV1.
4. Mescolare le culture che contiene il pTRV1 e pTRV2 (o il pTRV2 contenente il gene di interesse) in un rapporto 1 a 1. Includono anche una pTRV2-PDS controllo. Si prega di notare che la concentrazione acetosyringone finale è ora 200 micron e che ogni cultura è a ₆₀₀ OD di 0,15.
5. Etichetta le piantine di essere infiltrati con il gene per essere messa a tacere e la data dell'esperimento.
6. Fare un buco in ogni foglia di essere infiltrati con un ago. Utilizzare una siringa da 1 ml manco a infiltrarsi nella sospensione batterica nelle piantine. Per il pomodoro, si infiltrano entrambi i cotiledoni mentre per N. benthamiana, infiltrare il più grande due foglie vere. Cinque mL di ciascuna miscela batterica dovrebbe essere sufficiente per infiltrarsi 15 N. benthamiana e 25 piantine di pomodoro. Evitare la contaminazione incrociata, cambiando i guanti tra infiltrazioni e non innaffiare le piante fino al giorno successivo, dopo l'inoculazione.
7. Gli impianti sono tenuti a 20-22 ° C in una camera di crescita con una lunghezza del giorno 16 ore e 50% UR per almeno 3 settimane e mezzo prima di poter essere utilizzato per le analisi.

Parte 3: I risultati rappresentativi

La Figura 1 mostra un esperimento rappresentativo con N. benthamiana e piante di pomodoro a tacere per PDS. Le piante mostrano il fenotipo caratteristico photobleaching osservato in impianti con diminuita quantità di carotenoidi. Per il PDS-tacere le piante di controllo, inizia photobleaching di essere visto non appena 1 ½ settimane dopo l'infiltrazione.

Figura 1. Silenziamento del gene di controllo PDS cause photobleaching in N. benthamiana (A) e pomodoro (B) le piante. Fotografie sono state scattate 3 settimane e mezzo dopo tacere.

Tabella 1. Preparazione del mezzo di induzione (IM).

400 mL	H 2 O distillata
4,88 g.	MES (2 - (4 morfolino)-etano solfonico)
2,5 g	Glucosio
0,12 g	NaH 2 PO 4

Portare ad un volume finale di 475 ml con dH ₂ O e portare il pH a 5,6. Autoclave. Dopo che il medium è raffreddato, aggiungere 25 ml di 20X sali AB.

Tabella 2. Preparazione di sali AB.

20 g	NH 4 Cl
6 g	MgSO 4 · 7H 2 O
3 g	KCl
0,2 g	CaCl 2
0,05 g	FeSO 4 · 7H 2 O

Portare ad un volume finale di 1 litro con acqua distillata. Autoclave. Essere consapevoli del fatto che i sali di AB precipitare come una polvere arancione. Basta mescolare bene agitando prima del loro utilizzo.

Tabella 3. Preparazione di 200 Acetosyringone mM. Si prega di notare che acetosyringone deve essere preparato il giorno in cui verrà utilizzato.

19,6 mg	Acetosyringone (3 ', 5'-Dimethoxy-4'-hydroxyacetophenone)
500 microlitri	DMSO (dimetil solfossido)

Discussion

Virale silenziamento genico è un metodo che permette un rapido schermi della genetica inversa. Evita la generazione di T-DNA o geni mediata trasposone knock-out, che sono disponibili solo in alcune piante come Arabidopsis e mais. Si aggira anche il processo che richiede tempo di trasformazione di piante e permette il targeting dei geni multipli allo stesso tempo, a condizione che abbiano homology sufficienti ¹⁰ o che diverse sequenze di host di destinazione sono disposti in tandem nel silenzio Vettoriale ^{6, 11.}

Tuttavia, tacere non è mai efficiente al 100% e, pertanto, è necessario prestare attenzione nell'interpretazione dei risultati. Un risultato negativo può semplicemente indicare che la concentrazione di proteine ​​residue era sufficiente per svolgere la sua funzione senza evidenti conseguenze fenotipiche. Inoltre, alcuni costrutti sono meglio a tacere di altri quindi è sempre consigliabile utilizzare almeno due regioni mRNA differenti per generare i costrutti di silenziamento per ogni gene. Inoltre, c'è sempre la possibilità di off-target a tacere se non vi è sufficiente omologia di un gene con la costruzione di tacere o se siRNA secondarie, che possono causare tacere transitiva, vengono prodotti ^12. Questo vale soprattutto per le famiglie di geni. E 'quindi della massima importanza per quantificare l'efficienza di silenziamento del vostro target e fuori bersaglio i geni, sia mediante RT-PCR o analisi Northern blot. Se RT-PCR è scelto come metodo per stimare l'efficienza VIGS, uno dei primer dovrebbe temprare al gene di fuori della regione di destinazione per far tacere in modo che la trascrizione prodotte dal virus non è amplificata ed i risultati rispecchiano le reali dowregulation di un particolare gene endogeno.

Efficienza VIGS è sempre più grande in N. benthamiana quanto lo sia in pomodoro. Pertanto, la cautela deve essere presa quando tacere piantine di pomodoro. In pomodoro, è fondamentale scegliere il giusto stadio di sviluppo dell'impianto e per mantenere le giuste condizioni ambientali per la diffusione virale. Inoltre, trascrizione abbondanza gene deve essere effettuata per ogni impianto in fase di studio. Inoltre, di solito in VIGS pomodoro, la A. tumefaciens ceppo è GV3101 mentre in N. benthamiana sia GV3101 GV2260 o vengono utilizzati ^6,13. E 'possibile ridurre al silenzio un gene utilizzando una sequenza eterologo da un'altra specie, purché vi sia sufficiente omologia tra i due. Inoltre, quando la costruzione di un pTRV2 bersaglio vettore genico, lunghezze inserire dovrebbe essere nel range da 200 a 1000 bp e non dovrebbe includere le regioni omopolimero (ad esempio le code di poli A) ^14.

Se le culture portando pTRV2 con i geni di interesse contaminati con PDS, a volte non photobleaching sarà osservato. Al contrario, le piante avranno una statura più breve. Pertanto, è fondamentale per ridurre al minimo qualsiasi fonte di contaminazione crociata durante l'esperimento che potrebbe potenzialmente pregiudizi i vostri risultati.