Summary
Descripción de un virus inducida por silenciamiento génico (VIGS) método de derribo de la expresión génica en
Abstract
ARN de interferencia (ARNi) es una muy específica silenciamiento génico fenómeno desencadenado por dsRNA 1. Este mecanismo de silenciamiento utiliza dos clases principales de los reguladores de ARN: los microRNAs, que se producen a partir de los genes que codifican proteínas y ARN corto de interferencia (siRNA). Las plantas utilizan la RNAi para controlar los transposones y ejercer un estricto control sobre los procesos de desarrollo tales como la formación de órganos florales y desarrollo de las hojas 2,3,4. Las plantas también el uso de RNAi para defenderse de la infección por virus. En consecuencia, muchos virus han evolucionado de silenciamiento de genes supresores de permitir la colonización exitosa de su anfitrión 5.
Inducida por el virus de silenciamiento génico (VIGS) es un método que se aprovecha de la planta mediante RNAi mecanismo de defensa antiviral. En las plantas infectadas con el virus sin modificar el mecanismo está dirigido específicamente contra el genoma viral. Sin embargo, con los vectores de virus que lleva las secuencias derivadas de los genes del hospedador, el proceso puede ser, además, dirigidos contra el ARNm de host correspondiente. VIGS ha sido adaptado de alto rendimiento para la genómica funcional en plantas mediante el uso de los patógenos de plantas Agrobacterium tumefaciens para ofrecer, a través de su plásmido Ti, un virus recombinante que lleva la totalidad o parte de la secuencia del gen diana para silenciar. Propagación del virus y la endógena sistémica planta de RNAi maquinaria cuidar de los demás. dsRNAs correspondiente a la meta de genes se producen y se escinde luego por la ribonucleasa Dicer en siRNA de 21 a 24 nucleótidos de longitud. Estos siRNAs en última instancia, la Guía del silenciamiento inducido por ARN complejo (RISC) para degradar la transcripción de la meta 2.
Diferentes vectores se han utilizado en VIGS y uno de los más utilizados se basa en el tabaco sonajero virus (TRV). TRV es un virus bipartito y, como tales A., dos diferentes tumefaciens cepas se utilizan para VIGS. Uno lleva pTRV1, que codifica las funciones de replicación viral y el movimiento mientras que el otro, pTRV2, alberga la proteína de la cubierta y la secuencia utilizada para VIGS 6,7. La inoculación de Nicotiana benthamiana y plántulas de tomate con una mezcla de ambas cepas de resultados en el silenciamiento de genes. El silenciamiento de la endógena fitoeno desaturasa (PDS) de genes, lo que hace que photobleaching, se utiliza como control de la eficiencia VIGS. Cabe señalar, sin embargo, que el silenciamiento de tomate suele ser menos eficiente que en N. benthamiana. La abundancia de transcripción de ARN del gen de interés siempre se debe medir para asegurarse de que el objetivo de genes de manera eficiente ha sido regulados. Sin embargo, las secuencias de genes heterólogos de N. benthamiana puede ser utilizado para silenciar a sus respectivos orthologs en el tomate y viceversa 8.
Protocol
Parte 1: El material vegetal
Plantas de N. benthamiana utiliza para silenciar debe estar alrededor de 2 ½ semanas de edad, que es el momento en que los cotiledones y las primeras 2 a 4 hojas verdaderas, han surgido. Tomate (Solanum lycopersicum) se utilizan plantas 7 a 8 días después de la emergencia, cuando las hojas verdaderas aún no han aparecido.
Parte 2: VIGS
DIA 1
- Para cada experimento, Agrobacterium tumefaciens albergar pTRV1, pTRV2, pTRV2-PDS y pTRV2-host objetivo de genes se cultivan en placas de agar LB suplementado con 50 mg / ml de kanamicina y 100 ug / ml de rifampicina. La kanamicina selecciona para el pTRV plásmido, mientras que la rifampicina lo hace por el Agrobacterium. Incubar la placa a 30 ° C durante 2 días.
El silenciamiento de la PDS hará que las plantas photobleach y se utiliza como un control de eficiencia de silenciamiento. Además, los genes que se downregulated debe ser clonado en un vector pTRV2. Hay una puerta de enlace compatible pTRV2 vector que puede facilitar la clonación y es descrito por Liu et al. (2002).
DÍA 3
- Inocular un 2 a 3 ml de cultivo líquido de LB con los antibióticos antes mencionados para cada una de las cepas. Incubar por agitación a 30 ° C durante 16 a 18 horas y 200 rpm
DIA 4
- Inocular a 1: 25 de dilución del cultivo primario en un medio de inducción secundaria líquida (IM) la cultura de mensajería instantánea con kanamicina, rifampicina y 200 acetosiringona M (Tablas 1, 2 y 3). El acetosiringona se utiliza como inductor de los genes vir de Agrobacterium que se requieren para la transferencia de T-ADN en la planta 9, mientras que el IM imita el ambiente de este encuentro de patógenos en el apoplasto de acogida. Incubar por agitación a 30 ° C durante 20 - 24 horas y 200 rpm
DIA 5
- Recoger las células por centrifugando durante 10 minutos a 3000 x g. Resuspender en el mismo volumen que la cultura original tenía con 10 mM de MgCl2, 10 mM MES pH 5,5. Las células pueden ser suavemente vortex para resuspender.
- Centrifugue las células de nuevo durante 10 minutos a 3000 x g. Resuspender en la mitad del volumen de la cultura original con 10 mM de MgCl2, 10 mM MES pH 5,5.
- Preparar una suspensión bacteriana con una OD 600 de 0,3 por cada cultivo bacteriano. Añadir acetosiringona a una concentración final de 400 M de la cultura pTRV1.
- Mezcla de las culturas que contiene el pTRV1 y el pTRV2 (o el pTRV2 que contiene el gen de interés) en una proporción de 1 a 1. También incluye un control pTRV2-PDS. Tenga en cuenta que la concentración acetosiringona final es ahora 200 micras y que cada cultura se encuentra en un 600 OD de 0,15.
- Etiqueta de las plántulas que se infiltró con el gen de ser silenciada y la fecha de la prueba.
- Haga un agujero en cada hoja que se infiltra con una aguja. Use una jeringa de 1 ml innecesaria para infiltrarse en la suspensión bacteriana en las plantas. Para el tomate, se infiltran en los cotiledones, mientras que para N. benthamiana, se infiltran en el más grande dos hojas verdaderas. Cinco ml de cada mezcla bacteriana debería ser suficiente para infiltrarse en 15 N. benthamiana y 25 plántulas de tomate. Evite la contaminación cruzada al cambiar los guantes entre infiltraciones y por no regar las plantas hasta el día siguiente después de la inoculación.
- Las plantas se mantienen a 20-22 ° C en cámara de crecimiento con una longitud de día de 16 horas y el 50% de humedad relativa durante al menos 3 semanas y media antes de que puedan ser utilizados para los ensayos.
Parte 3: Los resultados representativos
La figura 1 muestra un experimento representativo con N. benthamiana y silenciado por las plantas de tomate PDS. Las plantas muestran el fenotipo característico photobleaching observado en las plantas con una cantidad disminuida de los carotenoides. Para el PDS-silenciado las plantas de control, comienza a ser visto photobleaching tan pronto como 1 ½ semanas después de la infiltración.
Figura 1. Silenciamiento del gen de control PDS causas photobleaching en N. benthamiana (A) y las plantas de tomate (B). Las fotografías fueron tomadas 3 semanas y media después de silenciar.
Tabla 1. Preparación del medio de inducción (IM).
| 400 ml | H 2 O destilada |
| 4,88 g | MES (2 - (4 morfolino)-etano sulfónico) |
| 2,5 g | Glucosa |
| 0,12 g | NaH 2 PO 4 |
Llevar a un volumen final de 475 ml con dH 2 O y ajustar el pH a 5.6. Autoclave. Después de que el medio se haya enfriado, agregar 25 ml de 20X sales AB.
Tabla 2. Preparación de sales de AB.
| 20 g | NH 4 Cl |
| 6 g | MgSO 4 · 7H 2 O |
| 3 g | KCl |
| 0,2 g | CaCl2 |
| 0,05 g | FeSO 4 · 7H 2 O |
Llevar a un volumen final de 1 litro con agua destilada. Autoclave. Tenga en cuenta que las sales se precipitan como AB un polvo de color naranja. Sólo tienes que mezclar bien por agitación antes de su uso.
Tabla 3. Preparación de acetosiringona 200 mm. Tenga en cuenta que acetosiringona debe estar preparado el día en que se utilizará.
| 19,6 mg | Acetosiringona (3 ', 5'-dimetoxi-4 '-hidroxiacetofenona) |
| 500 l | DMSO (dimetilsulfóxido) |
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Discussion
Inducida por el virus de silenciamiento génico es un método que permite una rápida pantallas de genética inversa. Evita la generación de T-ADN o genes transposón mediada por knock-out, que sólo están disponibles en ciertas plantas como Arabidopsis y el maíz. También se evita el proceso que lleva tiempo de transformación de la planta y permite la focalización de los múltiples genes al mismo tiempo, siempre que tengan suficiente homología de 10 o de que las diferentes secuencias de host de destino están dispuestos en tándem en el silenciamiento de vector 6, 11.
Sin embargo, silenciar nunca es eficaz al 100% y por lo tanto, se debe tener cuidado al interpretar los resultados. Un resultado negativo puede indicar simplemente que la concentración de proteína residual era suficiente para llevar a cabo su función sin obvias consecuencias fenotípicas. Además, algunas construcciones son mejores que otros a silenciar lo que siempre es recomendable utilizar al menos dos regiones diferentes ARNm para generar las construcciones silenciamiento para cada gen. Además, siempre existe la posibilidad de silenciar fuera del objetivo si no hay suficiente homología de un gen con la construcción de silenciar o si siRNAs secundarios, que pueden provocar el silenciamiento transitivo, se producen 12. Esto es especialmente cierto para las familias de genes. Por tanto, es de suma importancia para cuantificar la eficacia de silenciamiento de genes y su objetivo fuera de objetivo, ya sea por RT-PCR o análisis de Northern blot. Si RT-PCR es elegido como el método para estimar la eficiencia VIGS, uno de los primers debe recocer que el gen fuera de la región dirigidas a silenciar lo que la transcripción se produce por el virus no es amplificada y los resultados reflejan realmente la dowregulation de un gen endógeno en particular.
Eficiencia VIGS es siempre mayor en el Norte benthamiana que en tomate. Por lo tanto, se debe tener cuidado al silenciamiento de las plántulas de tomate. En el tomate, es fundamental para elegir la etapa de desarrollo de la planta y el derecho de mantener condiciones ambientales adecuadas para la propagación viral. Además, la abundancia de transcripción de genes se deben realizar para cada planta en estudio. Además, por lo general en VIGS de tomate, el A. tumefaciens cepa GV3101 es, mientras que en N. benthamiana sea GV3101 o GV2260 se utilizan 6,13. Es posible silenciar un gen que emplean una secuencia heteróloga de otra especie, siempre y cuando haya suficiente homología entre los dos. Además, cuando se construye un vector génico pTRV2 objetivo, la longitud de inserción debe estar en el rango de 200 a 1000 pb y no deben incluir las regiones homopolymeric (por ejemplo, las colas poli A) 14.
Si los cultivos llevar pTRV2 con los genes de interés se contaminan con PDS, a veces no photobleaching será observado. En cambio, las plantas tienen una estatura más corta. Por lo tanto, es fundamental para reducir al mínimo las fuentes de contaminación cruzada durante el experimento que podría potencialmente el sesgo de sus resultados.
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Acknowledgments
Agradecemos a la Dra. Patricia Manosalva por su valiosa información sobre el manuscrito. El financiamiento fue proporcionado por el Programa Nacional de Ciencia Fundación Genoma Vegetal, el número de premios DBI-0605059.
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