Induite par le virus Gene Silencing (VIGS) dans Nicotiana benthamiana Et aux tomates

Summary

Description d'une induite par le virus gene silencing (VIGS) méthode pour le knock-down de l'expression génique dans le

Abstract

L'interférence ARN (ARNi) est un très spécifiques de silençage génique phénomène déclenché par ^une ARNdb. Ce mécanisme utilise taire deux grandes classes de régulateurs d'ARN: les microARN, qui sont produites à partir non des gènes codant des protéines et des courts ARN interférents (siRNA). Les plantes utilisent l'ARNi pour contrôler les transposons et d'exercer un contrôle serré sur les processus de développement tels que la formation des organes de fleurs et de ^2,3,4 développement des feuilles. Plantes également utiliser l'ARNi pour se défendre contre l'infection par des virus. En conséquence, de nombreux virus ont évolué suppresseurs de gènes taire pour permettre leur colonisation réussie de leur hôte ^5.

Induite par le virus gene silencing (VIGS) est une méthode qui prend avantage de l'usine de l'ARNi à médiation mécanisme de défense antivirale. Chez les plantes infectées par des virus non modifiés, le mécanisme est spécifiquement ciblées contre le génome viral. Cependant, avec des vecteurs viraux portant des séquences dérivées de gènes de l'hôte, le processus peut en outre être ciblées contre les ARNm hôte correspondant. VIGS a été adapté à haut débit de génomique fonctionnelle chez les plantes en utilisant la plante pathogène Agrobacterium tumefaciens pour offrir, via son plasmide Ti, un virus recombinant portant la totalité ou une partie de la séquence du gène ciblé pour réduire au silence. La propagation du virus systémique et les plantes endogènes ARNi machines prendre soin du reste. dsRNA correspondant au gène cible sont produites et ensuite clivée par la ribonucléase Dicer en siRNA de 21 à 24 nucléotides de long. Ces siRNA finalement guider la RNA-Induced Silencing complexes (RISC) à dégrader la transcription cible ^2.

Différents vecteurs ont été utilisés dans VIGS et l'un des plus fréquemment utilisée est basée sur le tabac hochet virus (TRV). VRT est un virus bipartite et, comme tels, A. différentes deux tumefaciens souches sont utilisées pour VIGS. On réalise pTRV1, qui code les fonctions de réplication virale et le mouvement tandis que l'autre, pTRV2, ports la protéine d'enveloppe et de la séquence utilisée pour VIGS ^6,7. L'inoculation de Nicotiana benthamiana et plants de tomates avec un mélange de souches des résultats aussi bien dans le silençage génique. Désactivation de l'endogènes phytoène désaturase (PDS) du gène, ce qui provoque photoblanchiment, est utilisé comme un contrôle d'efficacité VIGS. Il faut noter, cependant, que l'inhibition de la tomate est généralement moins efficace que dans N. benthamiana. L'abondance de transcription d'ARN du gène d'intérêt doit toujours être mesuré afin de s'assurer que le gène cible a été efficacement régulé à la baisse. Néanmoins, les séquences de gènes hétérologues de N. benthamiana peut être utilisé pour réduire au silence leurs orthologues chez la tomate et ⁸ vice-versa.

Protocol

Partie 1: Les matières végétales

N. benthamiana utilisées pour faire taire devrait être d'environ 2 ½ semaines qui est le moment où les cotylédons et les 2 premiers - 4 vraies feuilles ont émergé. Tomate (Solanum lycopersicum) les plantes sont utilisées de 7 à 8 jours après l'émergence, quand les feuilles vraies ne sont pas encore apparues.

Partie 2: VIGS

JOUR 1

1. Pour chaque expérience, Agrobacterium tumefaciens hébergeant pTRV1, pTRV2, pTRV2-PDS et gène cible pTRV2-hôtes sont cultivées sur des plaques d'agar LB additionné de 50 pg / ml de kanamycine et 100 pg / mL de rifampicine. La kanamycine sélectionne pour la pTRV plasmide alors que la rifampicine fait pour l'Agrobacterium. Incuber la plaque à 30 ° C pendant 2 jours.
   Désactivation du PDS causera les plantes à photobleach et est utilisé comme un contrôle d'efficacité taire. En outre, les gènes à régulation négative doit être cloné dans un vecteur pTRV2. Il ya une passerelle compatible pTRV2 vecteur qui peut faciliter le clonage et est décrit par Liu et al. (2002).

JOUR 3

1. Inoculer un 2 - 3 ml de culture liquide de LB avec les antibiotiques mentionnés ci-dessus pour chacune des souches. Incuber en secouant à 30 ° C pendant 16 - 18 heures et 200 tours par minute

JOUR 4

1. Inoculer un 1: 25 de dilution de la culture primaire dans un média secondaire induction liquide (IM) la culture de messagerie instantanée avec la kanamycine, la rifampicine et 200 acétosyringone uM (tableaux 1, 2 et 3). Le acétosyringone est utilisé comme un inducteur des gènes vir d'Agrobacterium qui sont requis pour le transfert de l'ADN-T dans la plante ⁹ tandis que le MI imite l'environnement de cette rencontre de pathogènes dans l'apoplaste hôte. Incuber en secouant à 30 ° C pendant 20 - 24 heures et 200 tours par minute

JOUR 5

1. Récolter les cellules par centrifugation pendant 10 minutes à 3000 x g. Remettre en suspension dans le même volume que la culture d'origine a eu avec 10 _mM MgCl2, 10 mM MES pH 5,5. Les cellules peuvent être vortexés doucement à les remettre en suspension.
2. Centrifugue les cellules pendant 10 minutes à 3000 x g. Remettre en suspension dans la moitié du volume de la culture d'origine avec 10 mM MgCl2, 10 mM MES pH 5,5.
3. Préparer une suspension bactérienne avec une DO ₆₀₀ de 0,3 pour chaque culture bactérienne. Ajouter acétosyringone à une concentration finale de 400 uM à la culture pTRV1.
4. Mélanger les cultures contenant de la pTRV1 et le pTRV2 (ou le pTRV2 contenant le gène d'intérêt) dans un rapport 1 pour 1. Incluent également un contrôle pTRV2-PDS. S'il vous plaît noter que la concentration finale est maintenant acétosyringone 200 uM et que chaque culture est à une DO ₆₀₀ de 0,15.
5. Étiqueter les semis d'être infiltré par le gène de se taire et la date de l'expérience.
6. Percer un trou dans chaque feuille doit être infiltré avec une aiguille. Utiliser une seringue de 1 mL inutiles pour infiltrer la suspension bactérienne dans le semis. Pour la tomate, infiltrer deux cotylédons tandis que pour N. benthamiana, infiltrer les deux plus grandes feuilles vraies. Cinq ml de chaque mélange bactérien devrait être suffisant pour infiltrer 15 N. benthamiana et 25 plants de tomates. Évitez la contamination croisée en changeant de gants entre les infiltrations et par ne pas arroser les plantes avant le lendemain après l'inoculation.
7. Les plantes sont maintenus à 20 - 22 ° C dans une chambre de croissance avec une longueur de journée de 16 heures et 50% HR pendant au moins 3 semaines et demie avant qu'ils peuvent être utilisés pour les dosages.

Partie 3: Les résultats représentatifs

La figure 1 montre une expérience représentative avec N. benthamiana et des plants de tomates réduites au silence pour PDS. Plantes montrer le phénotype caractéristique de photoblanchiment observée dans les usines avec des quantités diminuées de caroténoïdes. Pour la PDS-taire des plantes témoins, commence photoblanchiment d'être vu dès que 1 ½ semaines après l'infiltration.

Figure 1. Désactivation du gène de contrôle du PDS cause photoblanchiment de N. benthamiana (A) et la tomate (B) des plantes. Les photographies ont été prises trois semaines et demi après taire.

Tableau 1. Préparation du milieu d'induction (GI).

400 ml	H 2 O distillée
4,88 g	MES (2 - (4 morpholino) éthane sulfonique)
2,5 g	Le glucose
0,12 g	NaH 2 PO 4

Porter à un volume final de 475 ml avec dH ₂ O et ajuster le pH à 5,6. Autoclave. Après que le milieu est refroidi, ajouter 25 ml de sels AB 20X.

Tableau 2. Préparation de sels AB.

20 g	NH 4 Cl
6 g	MgSO 4 · 7H 2 O
3 g	KCl
0,2 g	CaCl 2
0,05 g	FeSO 4 · 7H 2 O

Porter à un volume final de 1 litre avec de l'eau distillée. Autoclave. Soyez conscient que les sels AB précipiter sous forme d'une poudre orange. Il suffit de les mélanger en remuant avant leur utilisation.

Tableau 3. Préparation de 200 acétosyringone mM. S'il vous plaît noter que acétosyringone doivent être préparés le jour où il sera utilisé.

19,6 mg	Acétosyringone (3 ', 5'-diméthoxy-4'-hydroxyacétophénone)
500 ul	DMSO (diméthylsulfoxyde)

Discussion

Induite par le virus gene silencing est une méthode qui permet rapidement inversée écrans génétique. Il évite la génération de T-ADN ou le gène médié transposon knock-outs, qui ne sont disponibles que dans certaines plantes comme Arabidopsis et le maïs. Il contourne le processus fastidieux de transformation des plantes et permet le ciblage de gènes multiples dans le même temps, à condition qu'ils aient une homologie suffisante ¹⁰ ou que les différentes séquences cibles d'hôte sont disposés en tandem dans le silence vecteur de ^{6, 11.}

Cependant, le silence n'est jamais efficace à 100% et donc, des précautions doivent être prises lors de l'interprétation des résultats. Un résultat négatif peut simplement indiquer que la concentration de protéine résiduelle est suffisante pour mener à bien sa fonction sans conséquences phénotypiques évidentes. En outre, certaines constructions sont mieux à faire taire que les autres donc il est toujours conseillé d'utiliser au moins deux régions différentes d'ARNm pour générer les constructions taire pour chaque gène. Par ailleurs, il ya toujours la possibilité de hors-cible taire s'il ya une homologie suffisante d'un gène de construire avec votre taire ou si siRNA secondaires, qui peuvent causer taire transitif, sont produites ^12. Cela est particulièrement vrai pour les familles de gènes. Il est donc primordial de quantifier l'efficacité au silence de votre cible et hors cible les gènes, soit par RT-PCR ou analyses par Northern blot. Si la RT-PCR est choisi comme méthode pour estimer l'efficacité VIGS, l'une des amorces doit recuit à l'extérieur de la région du gène ciblé pour faire taire de sorte que la transcription étant produite par le virus n'est pas aussi amplifiée et les résultats reflètent réellement les dowregulation des un gène particulier endogène.

L'efficacité VIGS est toujours supérieure à N. benthamiana que dans la tomate. Par conséquent, il faut être prudent quand taire plants de tomate. Dans la tomate, il est essentiel de choisir le stade de la plante droit au développement et à maintenir des conditions environnementales appropriées pour la propagation virale. En outre, l'abondance de transcription génique doit être effectuée pour chaque usine à l'étude. De plus, généralement dans VIGS tomate, le A. souche tumefaciens est GV3101 tout en N. benthamiana soit GV3101 GV2260 ou sont utilisés ^6,13. Il est possible de réduire au silence un gène employant une séquence hétérologue d'une autre espèce, à condition qu'il soit suffisamment d'homologie entre les deux. Aussi, lors de la construction d'un vecteur du gène-cible pTRV2, les longueurs d'insertion doit être de l'ordre de 200 à 1000 pb et ils ne devraient pas inclure les régions homo (par exemple poly A queues) ^14.

Si les cultures transportant pTRV2 avec les gènes d'intérêt deviennent contaminés par le PDS, parfois sans photoblanchiment sera observée. Au lieu de cela, les plantes auront une stature plus courte. Par conséquent, il est essentiel de minimiser les sources de contamination croisée pendant l'expérience qui pourrait biaiser vos résultats.