ウイルス誘導ジーンサイレンシング（VIGS）でタバコbenthamianaとトマト

Summary

ノックダウン遺伝子発現の内のウイルス誘発性遺伝子サイレンシング（VIGS）メソッドの説明

Abstract

RNA干渉（RNAi）は、dsRNAの¹によって引き起こさ非常に特異的な遺伝子サイレンシングの現象です。マイクロRNA、非蛋白質をコードする遺伝子と短い干渉RNA（siRNA）から生成されています：このサイレンシング機構は、RNAのレギュレータの2つの主要なクラスを使用しています。植物は、トランスポゾンを制御するため、および花の器官形成と葉の開発^2,3,4などの発達過程を厳密にコントロールを発揮するために、RNAiを使用してください。植物はまた、ウイルスによる感染から身を守るために、RNAiを使用してください。その結果、多くのウイルスはその宿主⁵の彼らの成功した植民地化を可能にするためにサイレンシング遺伝子の抑制を進化させてきた。

ウイルス誘発性遺伝子サイレンシング（VIGS）は、植物RNAiによる抗ウイルス防御機構を利用する方法です。変更されていないウイルスに感染した植物では機構は、特にウイルスのゲノム比較対象としています。しかし、ホストの遺伝子由来の配列を有するウイルスベクターを用いて、プロセスはさらに、対応するホストのmRNAを対象とすることのできる。 VIGSは、プラスミド、そのチタン、全体またはサイレンシングの対象となる遺伝子配列の一部を担持する組換えウイルスを介して、配信するために植物病原体アグロバクテリウムツメファシエンスを使用して、植物におけるハイスループットゲノム機能解析に適応されています。全身性ウイルスの拡散と内生植物のRNAi機構は、残りの世話をする。標的遺伝子に対応するdsRNAは長さ21〜24ヌクレオチドのsiRNAへのリボヌクレアーゼのダイサーによって生成され、その後切断されています。これらのsiRNAは最終的にターゲット転写物^2を分解するRNA誘導サイレンシング複合体（RISC）を導く。

異なるベクターはVIGSで採用されていると、最も頻繁に使用されるのいずれかがタバコ茎えそウイルス（TRV）に基づいています。 TRVは、二分ウイルスであり、そのような、二つの異なるAとしてツメファシエンス株は 、VIGSに使用されます。一つは、pTRV2、他のコートタンパク質とVIGS ^6,7のために使用されるシーケンスを庇護しながら複製し、動きのウイルスの機能をコードpTRV1を、運びます。遺伝子サイレンシングの菌株の結果、両方の混合物とタバコbenthamianaとトマトの苗を接種。退色の原因内因性フィトエンデサチュラーゼ（PDS）遺伝子のサイレンシングは、VIGSの効率のためのコントロールとして使用されます。それはトマトのサイレンシングは通常Nに比べて非効率であること、しかし、注意すべきであるbenthamiana。目的の遺伝子のRNA転写物の豊富さは、常に、ターゲット遺伝子を効率的にダウンレギュレートされていることを保証するために測定する必要があります。 N.からそれにもかかわらず、異種遺伝子配列benthamiana、トマト、その逆も⁸で、それぞれのオルソログを黙らせるために使用することができます。

Protocol

パート1：植物材料

サイレンシングのために使用されるN. benthamiana植物は2前後となるはず½子葉や最初の2時間である週は古い- 4本葉が浮上している。 8日間の後出現、真の葉はまだ登場していない-トマト（ トマト ）の植物は、7を使用されています。

パート2：VIGS

1日目

1. 各実験、pTRV1をかくまってアグロバクテリウムツメファシエンス 、pTRV2の場合は、pTRV2 - PDSとpTRV2 -ホストの標的遺伝子は、カナマイシン50μg/ mLのとリファンピシンの100μg/ mlのを補充したLB寒天プレート上で増殖されています。リファンピシンは、 アグロバクテリウムのためにそうする間、カナマイシンは、プラスミドpTRVのために選択されます。 2日間、30℃でインキュベートする。
   PDSのサイレンシングは退色するために植物が発生し、サイレンシング効率制御として使用されます。また、ダウンレギュレートする遺伝子はpTRV2ベクターにクローン化されている必要があります。クローニングを容易にすることができるとLiuらによって記述されているゲートウェイの互換性のあるpTRV2ベクトルがあります。 （2002）。

3日目

1. 菌株のそれぞれについて、上記の抗生物質とLBの3 mLの液体培養 - 2を接種する。 18時間、200 rpmの - 16、30℃で振とうしてインキュベートします。

4日目

1. カナマイシン、リファンピシンおよび200μMのアセトシリンゴン（表1、2、3）と二次液体誘導メディア（IM）、IMの文化に初代培養の25倍希釈：1接種する。アセトシリンゴンは、IMは、環境のホストのアポプラストにおけるこの病原体の出会いを模倣しながら工場⁹にT - DNAの伝達のために必要とされているアグロバクテリウムのvir遺伝子の誘導物質として使用されます。 20分間30℃で振とうしてインキュベートする - 24時間、200 rpmの

5日目

1. 3000 × gで10分間centrifugatingして細胞を収集するオリジナルの文化が10mMのMgCl _2、10mMのMES pHを5.5に持っていたのと同じボリュームに再懸濁します。細胞を穏やかにそれらを再懸濁するためにボルテックスすることができます。
2. 3000 xgで10分間、再び細胞をCentrifugue 10mMのMgCl2を、10mMのMES液（pH5.5）で元の培養液の半分量に再懸濁します。
3. 各細菌培養は、0.3のOD ₆₀₀との細菌懸濁液を準備します。 pTRV1文化〜400μMの最終濃度にアセトシリンゴン追加。
4. pTRV1と1対1の割合でpTRV2を（または目的の遺伝子を含むpTRV2）を含む培養液を混ぜる。またpTRV2 - PDSのコントロールが含まれています。最後のアセトシリンゴン濃度が現在は200μMであり、それぞれの文化が0.15のOD ₆₀₀に位置していることに注意してください。
5. 沈黙する遺伝子と実験の日付を浸透する苗木にラベルを付けます。
6. 針を浸透するために、各葉に穴を開けない。苗に細菌懸濁液を浸透させるために1 mLの不必要な注射器を使用してください。トマトの場合は、Nの間に、両方の子葉に潜入benthamianaは 、最大のtwo真の葉に浸潤する。各細菌の混合物の5mlのは、15 N を浸透させるために十分なはずですbenthamianaと25トマトの苗。浸潤との間および接種後次の日までの植物の水遣りしないことにより、手袋を変更することにより、クロスコンタミネーションを避ける。
7. 植物は20℃に保たれている - 22 ° C 16時間の日長とそれらがアッセイに使用される前に、少なくとも3 ½の週間50％RHと成長チャンバーインチ

パート3：代表的な結果

図1は、Nと代表的な実験を示しています。 PDSのために沈黙benthamianaとトマト。植物は、カロテノイドの減少量と植物で観察される特徴的な退色表現型を示す。 PDS -サイレンシング制御の植物のため、浸潤後1 ½の週とすぐに見られるように開始を光退色。

図1。PDS制御遺伝子のサイレンシングは、N. benthamiana（A）とトマト（B）植物の光退色が発生します。写真は、3 ½の週間サイレンの後に撮影された。

表1。誘導培地（IM）の調製。

400mLの	蒸留H 2 O
4.88グラム	MES（2 - （4モルホリノ）エタンスルホン酸）
2.5グラム	グルコース
0.12グラム	のNaH 2 PO 4

のdH ₂ Oで475 mlの最終体積に持参し、5.6にpHを調整する。オートクレーブ。培地冷却された後、20X AB塩の25 mLを加え。

表2。AB塩の調製。

20グラム	NH 4 Clを
6グラ​​ム	し、MgSO 4 · 7H 2 O
3グラム	塩化カリウム
0.2グラム	CaCl 2の
0.05グラム	のFeSO 4 · 7H 2 O

蒸留水で1リットルの最終容量にもたらす。オートクレーブ。 AB塩は橙色の粉末として沈殿させることに注意してください。ちょうどその使用前に渦巻くことでよく混ぜる。

表3。200mMのアセトシリンゴンの準備。アセトシリンゴンは、それが使用される日を準備する必要があることに注意してください。

19.6ミリグラム	アセトシリンゴン（3'、5' -ジメトキシ-4' - ヒドロキシアセトフェノン）
500μL	DMSO（ジメチルスルホキシド）

Discussion

ウイルス誘発性遺伝子サイレンシングは、急速な逆遺伝学的スクリーンを可能にする方法です。それは、T - DNAまたはシロイヌナズナとトウモロコシのような特定の植物にのみ利用可能なトランスポゾン媒介遺伝子ノックアウトアウト、の生成が回避される。また、植物形質転換の時間のかかるプロセスを回避し、彼らが¹⁰またはその別のホストの標的配列を十分な相同性を持っていることを提供し、同時に複数の遺伝子の標的化がサイレンシングにタンデムでベクトル^6、11を配置されている。許可

しかし、サイレンシングは、決して効率が100％との結果を解釈するときにそのため、注意が必要です。否定的な結果は単に残留タンパク質濃度が明らかな表現型を引き起こすことなく、その機能を遂行するのに十分であったことを示している可能性があります。それは常にそれぞれの遺伝子のサイレンシングコンストラクトを生成するために少なくとも二つの異なるmRNAの領域を使用することをお勧めしますので、また、いくつかの構成要素が他よりもサイレンで優れています。あなたのサイレンシングコンストラクトまたは推移的サイレンシングを引き起こす可能性のある二次的siRNAは^、12を生産している場合と遺伝子の十分な相同性がある場合はさらに、オフターゲットサイレンシングの可能性が常にあります。これは遺伝子の家族のために特に当てはまります。それは、RT - PCRまたはノーザンブロット分析のいずれかによって、ターゲットとオフターゲット遺伝子のサイレンシング効率を定量化することが最も重要なのです。 RT - PCRはVIGSの効率を推定する方法として選択されている場合は、プライマーの一方は、ウイルスによって生成being転写物がまた増幅し、結果が真にのdowregulationを反映されないようにサイレンシングの対象地域外の遺伝子にannealてください特定の内在性遺伝子。

VIGS効率がNに常に大きくなりますそれがトマトにあるよりbenthamiana。トマトの苗を黙らせた際にそのため、注意が必要。トマトでは、それは右の植物の発達段階を選択すると、ウイルスの拡散のための適切な環境条件を維持するために重要です。また、遺伝子の転写産物量が検討されて各工場ごとに実行される必要があります。加えて、通常トマトのVIGSで、A.ツメファシエンス株はN.でGV3101中です。 benthamianaどちらGV3101またはGV2260は^、6,13を使用している。それは2つの間に十分な相同性が存在する限り、別の種から異種配列を採用する遺伝子を黙らせることが可能です。また、pTRV2標的遺伝子ベクターを構築する際に、インサートの長さは200〜1000塩基の範囲内でなければならず、彼らは、ホモポリマーの領域（例えば、ポリテール^）14が含まれることはありません。

ている場合の有益な遺伝子をpTRV2を運ぶの文化は、時には何退色が観察されることはありません、PDSで汚染される。その代わりに、植物は短い身長を持つことになります。したがって、それはバイアス結果を潜在的にできた、実験中に交差汚染の源を最小限に抑えることが重要です。