Descrição de um vírus induzida silenciamento de genes método (VIGS) para knock-down da expressão gênica em<em> Nicotiana benthamiana</em> E tomate.
Interferência de RNA (RNAi) é um fenômeno altamente específico gene silenciando-desencadeada por dsRNA 1. Este mecanismo de silenciamento usa duas classes principais de reguladores de RNA: microRNAs, que são produzidos a partir de proteínas não-genes que codificam e curto RNAs de interferência (siRNAs). As plantas usam RNAi para controle transposons e exercer um controlo apertado sobre os processos de desenvolvimento como a formação de órgãos florais e desenvolvimento de folhas 2,3,4. Plantas também usar RNAi para se defender contra a infecção por vírus. Conseqüentemente, muitos vírus evoluíram de silenciamento de genes supressores de permitir sua colonização bem sucedida de seu hospedeiro 5.
Induzida por vírus silenciamento gênico (VIGS) é um método que aproveita o mecanismo de defesa das plantas RNAi mediada antiviral. Em plantas infectadas com o vírus modificado o mecanismo é especificamente dirigidas contra o genoma viral. No entanto, com vetores de vírus carregando seqüências derivadas de genes do hospedeiro, o processo pode ser adicionalmente dirigidas contra o mRNAs de host correspondente. VIGS foi adaptado para high-throughput genômica funcional em plantas usando a planta patógeno Agrobacterium tumefaciens para oferecer, através da sua Ti plasmídeo, um vírus recombinante carregando toda ou parte da seqüência do gene alvo para silenciar. Propagação do vírus sistêmico e endógeno plantas RNAi máquinas cuidar do resto. dsRNAs correspondente ao gene-alvo são produzidas e depois clivado pela Dicer ribonuclease em siRNAs de 21 a 24 nucleotídeos de comprimento. Estes siRNAs em última análise, orientar a RNA induzida silenciamento complexos (RISC) para degradar a transcrição alvo 2.
Diferentes vetores têm sido empregadas em VIGS e um dos mais utilizados é baseado em tabaco rattle vírus (TRV). TRV é um vírus bipartido e, como tal, A. dois diferentes cepas tumefaciens são usados para VIGS. Um carrega pTRV1, que codifica as funções de replicação e movimento viral, enquanto o outro, pTRV2, abriga a capa protéica ea seqüência utilizada para VIGS 6,7. Nicotiana benthamiana inoculação de mudas de tomate e com uma mistura de ambas as linhagens resultados no silenciamento gênico. Silenciamento do gene endógeno fitoeno desaturase (PDS), que causa fotobranqueamento, é usado como um controle para a eficiência VIGS. Deve-se notar, no entanto, que o silenciamento em tomate é normalmente menos eficiente do que em N. benthamiana. RNA abundância transcrição do gene de interesse deve ser sempre medida para garantir que o gene-alvo tem sido eficiente para baixo-regulado. No entanto, seqüências de genes heterólogos a partir de N. benthamiana podem ser usadas para silenciar seus respectivos ortólogos no tomate e vice-versa 8.
Induzida por vírus silenciamento do gene é um método que permite rápida reverter telas genética. Ele evita a geração de T-DNA ou gene mediada transposon knock-outs, que só estão disponíveis em certas plantas, como Arabidopsis e de milho. Ele também contorna o processo demorado de transformação de plantas e permite o direcionamento de múltiplos genes, ao mesmo tempo, desde que tenham 10 ou homologia suficiente que as seqüências alvo diferentes de acolhimento são dispostos em tandem no…
Agradecemos ao Dr. Patricia Manosalva para seus insights valiosos sobre o manuscrito. O financiamento foi fornecido pelo National Science Foundation Programa Genoma Plant, número prêmio DBI-0605059.