اكتشاف بروتين Ubiquitination

Summary

Ubiquitination هو تعديل مفتاح posttranslational التي قامت بها مجموعة من ثلاثة الانزيمات. ترتبط طفرات في الجينات المسؤولة عن هذا التعديل مع العديد من الأمراض البشرية المختلفة. هنا ، نحن تصف بروتوكولات للكشف عن البروتين في الخلايا ubiquitination مثقف

Abstract

Ubiquitination ، المرفق التساهمية من اليوبيكويتين ببتيد لاستهداف البروتينات ، هو تعديل مفتاح posttranslational التي قامت بها مجموعة من ثلاثة الانزيمات. وهي تشمل اليوبيكويتين - E1 تفعيل أنزيم اليوبيكويتين - E2 التصريف الانزيم ، واليوبيكويتين E3 يغاز. خلافا لE1 و E2 ، E3 عرض ligases اليوبيكويتين خصوصية الركيزة. من ناحية أخرى ، فإن العديد من الانزيمات deubiquitylating أدوارا في تجهيز البروتينات polyubiquitinated. يمكن أن يؤدي إلى تغيير Ubiquitination الاستقرار البروتين ، وتوطين الخلوية ، والنشاط البيولوجي. ترتبط طفرات في الجينات المسؤولة عن المسار ubiquitination / deubiquitination أو اختلال وظيفة نظام اليوبيكويتين مع العديد من الأمراض البشرية المختلفة مثل أنواع مختلفة من السرطان ، وتنكس عصبي ، والاضطرابات الأيضية. قد كشف ubiquitination تغيير أو العادي للبروتينات هدف توفير فهم أفضل عن التسبب في هذه الأمراض. هنا ، نحن تصف بروتوكولات للكشف عن البروتين في الخلايا ubiquitination مثقف

Protocol

اكتشاف بروتين في الخلايا ubiquitination مثقف

1. مثقف خلايا Transfect البلازميدات مع التعبير عن المصالح والبروتين (حاتمة الموسومة إصدار) اليوبيكويتين.
2. جعل كاملة العازلة تحلل الخلية (2 ٪ SDS ، 150 مم كلوريد الصوديوم ، و 10 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 8.0) مع orthovanadate 2mm والصوديوم ، و 50 ملي فلوريد الصوديوم ، ومثبطات الأنزيم البروتيني.
3. ليز الخلايا مع 100 ميكرولتر تحلل الخلية العازلة في لوحة (6 طبق سم). إذا تم استخدام أكبر صحن ، وضبط حجم وفقا لذلك. دوامة الطبق بعناية للسماح للتحلل العازلة تغطية المنطقة بأكملها من الخلايا المزروعة.
4. جمع الخلايا مع مكشطة الخلية ونقل lysates الخلية في أنبوب 1.5 مل إيبندورف. وضع أنبوب على صفيحة ساخنة على الفور ليغلي لمدة 10 دقيقة.
5. قص الخلايا مع جهاز صوتنة.
6. إضافة 900ul العازلة للتخفيف (10 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 8.0 ، 150 مم كلوريد الصوديوم ، EDTA 2 مم ، تريتون 1 ٪). احتضان العينات في درجة مئوية (4) ل30-60 دقيقة مع التناوب.
7. تدور العينات المخففة في XG 20000 لمدة 30 دقيقة. طاف نقل الناتج إلى أنبوب إيبندورف جديدة. يجب الحرص على عدم تعكير صفو بيليه.
8. قياس تركيز البروتين.
9. يعد البروتين A - G - agarose أو حبة مترافق الأضداد ضد البروتين المستهدف في منطقة عازلة متوافق (50 ٪ الطين). قطع نهاية ضيقة من طرف P - 200 ماصة ونقل 14-20 ميكرولتر من الراتنج ل500-1،500 ميكروغرام من lysates الخلية التي أعدت للمناعي. لخلايا ذات كفاءة عالية ترنسفكأيشن ، سوف يكون كافيا 500 ميكروغرام. للخلايا مع انخفاض كفاءة ترنسفكأيشن ، قد تكون هناك حاجة إلى مزيد من البروتين.
10. احتضان الخلية lysate - حبة الخليط في 4 درجات مئوية خلال الليل مع التناوب.
11. تدور باستمرار الخرز في 5000 x ج لمدة 5 دقائق. نضح لطاف. غسل راتنج مع الغسيل العازلة (10 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 8.0 ، 1 م كلوريد الصوديوم ، EDTA 1 ملم ، 1 ٪ NP - 40) مرتين.
12. تدور حبات لمرة أخيرة في XG 20000 لمدة 30 ثانية. نضح المخزن الغسيل المتبقية وتغلي الراتنج مع العازلة 2X تحميل SDS.
13. تحميل عينات على جل SDS - PAGE immunoblotting لتحليلها.
14. اكتشاف بروتين اليوبيكويتين والهدف مع الأضداد منها. لimmunoblotting ، ونحن عموما كشف اليوبيكويتين الأولى. وعندئذ يكون الغشاء المستخدمة للكشف عن البروتين عجل.

اكتشاف بروتين ubiquitination على الهدف عن طريق فحص في المختبر ubiquitination

1. جعل 5X ubiquitination العازلة (100 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 7.5 ، 25 مم MgCl2 ، 2.5 ملي DTT ، 10 ملي ATP). تخزينها في aliquots صغيرة في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر. بعض البروتوكولات أيضا إضافة فوسفات الكرياتين كيناز والكرياتين في المخزن المؤقت ^لل1،2 تجديد ATP.
2. لكل رد فعل ، وإعداد مزيج يحتوي على ما يلي :
   

   ميكرولتر 8	5X ubiquitination العازلة
   250 نانوغرام	ubiquitination E1
   500 نانوغرام	ubiquitination E2
   0.5 ميكروغرام	اليوبيكويتين
   0.5 ميكروغرام	بروتين من الفائدة
   	المياه لحجم الكلي 40 ميكرولتر

   والضوابط ، وإعداد ردود فعل مماثلة في غياب أي E1 ، E2 ، أو اليوبيكويتين.
3. احتضان الخليط عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة أو أكثر.
4. وقف رد الفعل بإضافة SDS - PAGE العازلة عينة ونموذج تغلي لمدة 10 دقيقة.
5. تحميل عينات على SDS - PAGE هلام immunoblotting لتحليلها.
6. اكتشاف بروتين اليوبيكويتين والهدف مع الأضداد منها.

Discussion

في هذا العرض ، ونحن أول من وصف الخطوات التي تسمح الكشف عن تعديل اليوبيكويتين على بروتين من الاهتمام في خلايا الثدييات مثقف. استخدمنا من أجل الكشف عن ubiquitination تحديدا على البروتين من الفائدة ، وليس على البروتينات المتفاعلة غير تساهمي ، وهو شرط صارم لتحلل الخلية ، وغسل ^1،3 مناعي. Ubiquitination ، الكشف عنها من قبل للبروتين مناعي الهدف في مثل هذه الحالة الصعبة تليها مكافحة اليوبيكويتين immunoblotting ، ولذلك فإن من المرجح أن تكون محددة للبروتين الهدف. لمنع deubiquitination البروتين خلال إجراءات تجريبية ، يمكن إضافة مثبطات انزيم deubiquitinating مثل N - ethylmaleimide وألدهيد اليوبيكويتين لجميع المخازن ^4. ومع ذلك ، فإنه من غير المحتمل أن تبقى نشطة الانزيمات deubiquitination الإجراء بعد 10 دقيقة الغليان. مسحات قوية أو سلالم الأنواع الجزيئية العالية وعادة ما تكون نتيجة لubiquitination. ويمكن تقييم درجة ubiquitination من البروتين ذات الاهتمام بمقارنة نسبة البروتين الهدف ubiquitinated / معدلة التجربة في ظروف عدة. وفي الوقت نفسه ، يتم تخفيض عموما الجزيئات الحرة اليوبيكويتين عندما يتم زيادة ubiquitination من البروتين المستهدفة. هذا البروتوكول هو مفيد أيضا للكشف عن الأخرى مثل تعديل اليوبيكويتين جزيء صغير مثل sumolyation وneddylation.

وصفنا أيضا في المختبر باستخدام مقايسة ubiquitination تنقية البروتينات أو المؤتلف. مختلف مكونات ubiquitination حاتمة الموسومة متاحة تجاريا. Ubiquitination يغاز E3 ليس من الضروري الاقتران اليوبيكويتين في المختبر.