Detectie van eiwit ubiquitinering

Summary

Ubiquitinatie is een belangrijke posttranslationele modificatie uitgevoerd door een set van drie enzymen. Mutaties van genen die betrokken zijn in deze wijziging worden geassocieerd met vele verschillende ziekten bij de mens. We beschrijven hier protocollen aan eiwit ubiquitinatie te detecteren in gekweekte cellen

Abstract

Ubiquitinatie, de covalente bevestiging van de polypeptide ubiquitine aan eiwitten richten, is een belangrijke posttranslationele modificatie uitgevoerd door een set van drie enzymen. Zij omvatten ubiquitine-activerend enzym E1, ubiquitine-conjugatie enzym E2 en E3 ubiquitine ligase. In tegenstelling tot bij E1 en E2, E3 ubiquitine ligasen weer te geven substraat specificiteit. Aan de andere kant, een groot aantal deubiquitylating enzymen hebben rollen in de verwerking polyubiquitinated eiwitten. Ubiquitinatie kan leiden tot een verandering van eiwitten stabiliteit, cellulaire lokalisatie en de biologische activiteit. Mutaties van genen die betrokken zijn bij de ubiquitinatie / deubiquitination pad of gewijzigd ubiquitine-systeem de functie worden geassocieerd met vele verschillende ziekten bij de mens, zoals verschillende soorten kanker, neurodegeneratie, en metabole stoornissen. De detectie van een veranderde of normale ubiquitinatie van target eiwitten kunnen voorzien in een beter inzicht in de pathogenese van deze ziekten. We beschrijven hier protocollen aan eiwit ubiquitinatie te detecteren in gekweekte cellen

Protocol

Detectie van eiwit ubiquitinatie in gekweekte cellen

1. Transfecteren gekweekte cellen met plasmiden uiting van de eiwit van belang en (epitoop-gemerkte versie van) ubiquitine.
2. Compleet te maken cellysis buffer (2% SDS, 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0) met 2 mM natrium orthovanadate, 50 mM natrium-fluoride, en proteaseremmers.
3. Lyse cellen met 100 pl cellysis buffer per plaat (6 cm schotel). Als er een grotere schotel wordt gebruikt, dienovereenkomstig aan te passen volume. Swirl de schotel voorzichtig te laten de lysis buffer bestrijken het gehele gebied van volwassen cellen.
4. Verzamel de cellen met een cel schraper en overdracht van de cellysaten in een 1,5 ml Eppendorf buis. Plaats de buis op een hete plaat direct aan de kook gedurende 10 minuten.
5. Shear de cellen met een sonicatie apparaat.
6. Voeg 900ul van verdunning buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% Triton). Incubeer monsters bij 4 ° C gedurende 30-60 minuten met rotatie.
7. Spin de verdunde monsters op 20.000 xg gedurende 30 minuten. Breng de resulterende supernatant naar een nieuwe eppendorfbuisje. Wees voorzichtig dat u de pellet te verstoren.
8. Meet de eiwit concentratie.
9. Bereid Proteïne A-of G-agarose bead-geconjugeerd antilichaam tegen het doelwit eiwit in een compatibele buffer (50% suspensie). Snijd het smalle uiteinde van een P-200 pipetpunt en overdracht 14-20 ul van hars aan 500-1,500 ug voorbereid cellysaten voor immunoprecipitatie. Voor cellen met een hoge transfectie-efficiëntie, zal 500 ug genoeg zijn. Voor cellen met een lage transfectie-efficiëntie, kunnen meer eiwit nodig.
10. Incubeer de cellysaat-kraal mengsel bij 4 ° C gedurende de nacht met rotatie.
11. Spin down de parels bij 5000 xg gedurende 5 minuten. Zuig het supernatant. Was de hars met het wassen buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40) twee keer.
12. Spin de kralen voor een laatste keer bij 20.000 xg gedurende 30 sec. Zuigen de resterende wasbuffer en kook de hars met 2X SDS laadbuffer.
13. Laad monsters op een SDS-PAGE gel voor immunoblot analyse.
14. Detecteren ubiquitine en het doelwit eiwit met de respectievelijke antilichamen. Voor immunoblotting, we doorgaans voor het eerst ontdekken ubiquitine. Het membraan zal vervolgens worden gebruikt om het eiwit neergeslagen op te sporen.

Detectie van ubiquitinatie op doel eiwit door middel van in-vitro-assay ubiquitinering

1. Maak 5x ubiquitinatie buffer (100 mM Tris-HCl, pH 7,5, 25 mM MgCl2, 2,5 mM DTT, 10 mM ATP). Bewaar ze in kleine porties bij -20 ° C gedurende maximaal 6 maanden. Sommige protocollen ook toevoegen creatine fosfaat en creatine kinase in de buffer voor de ATP-regeneratie ^1,2.
2. Voor elke reactie, een mengsel met de volgende:
   

   8 ul	5X ubiquitinering buffer
   250 ng	ubiquitinering E1
   500 ng	ubiquitinering E2
   0,5 ug	ubiquitine
   0,5 ug	eiwit van interesse
   	water tot 40 ui totaal volume

   Als controles, voor te bereiden soortgelijke reacties in de afwezigheid van een van beide E1, E2, of ubiquitine.
3. Incubeer dit mengsel bij 37 ° C gedurende 1 uur of langer.
4. Stop de reactie door het toevoegen van SDS-PAGE monsterbuffer en kook het monster gedurende 10 minuten.
5. Laad monsters op SDS-PAGE gel voor immunoblot analyse.
6. Detecteren ubiquitine en het doelwit eiwit met de respectievelijke antilichamen.

Discussion

In deze presentatie hebben we voor het eerst beschreven stappen die toelaten het detecteren van ubiquitine modificatie op een eiwit van interesse in gekweekte zoogdiercellen. Met het oog op ubiquitinatie specifiek te sporen op het eiwit van belang, niet op non-covalent interagerende eiwitten, gebruikten we een strikte voorwaarde voor cellysis, immunoprecipitatie en wassen ^1,3. Ubiquitinatie, gedetecteerd door immunoprecipitatie van target eiwit in zulk een harde voorwaarde, gevolgd door anti-ubiquitine immunoblotting, zal daarom waarschijnlijk specifiek voor de doelgroep eiwit. Om te voorkomen dat eiwit deubiquitination tijdens de experimentele procedures, kan ubiquitinerings enzym-remmers, zoals N-ethylmaleimide en ubiquitine aldehyde worden toegevoegd aan alle buffers ^4. Het is echter onwaarschijnlijk dat de deubiquitination enzymen actief blijven na 10 min. koken procedure. Sterke uitstrijkjes of ladders van hoog moleculaire species zijn meestal het gevolg van ubiquitinering. De mate van ubiquitinatie van het eiwit van belang kan worden beoordeeld door vergelijking van de verhouding van geübiquitineerde / ongemodificeerde doelwit eiwit in verschillende experimentele omstandigheden. Ondertussen zijn vrij ubiquitine-moleculen over het algemeen verlaagd als ubiquitinatie van target eiwit wordt verhoogd. Dit protocol is ook nuttig om andere ubiquitine-achtige kleine molecule wijziging, zoals sumolyation en neddylation op te sporen.

We hebben ook beschreven een in vitro assay ubiquitinatie met behulp van gezuiverde of recombinante eiwitten. Verschillende epitoop-gemerkte ubiquitinatie componenten zijn commercieel verkrijgbaar. Ubiquitinatie E3 ligase is niet nodig voor ubiquitine conjugatie in vitro.