Detektion von Protein Ubiquitination

Summary

Ubiquitinierung ist ein wichtiger posttranslationale Modifikation durch eine Gruppe von drei Enzymen durchgeführt. Mutationen von Genen in dieser Modifikation beteiligt sind mit vielen verschiedenen menschlichen Krankheiten assoziiert. Hier beschreiben wir Protokolle, um Protein-Ubiquitinierung in kultivierten Zellen erkennen

Abstract

Ubiquitinierung, die kovalente Bindung des Polypeptids Ubiquitin an Proteine ​​Ziel, ist ein wichtiger posttranslationale Modifikation durch eine Gruppe von drei Enzymen durchgeführt. Dazu gehören Ubiquitin-aktivierende Enzym E1, Ubiquitin-Konjugation Enzym E2 und E3-Ubiquitin-Ligase. Im Gegensatz zu E1 und E2, E3 Ubiquitin-Ligasen Display Substratspezifität. Auf der anderen Seite haben zahlreiche deubiquitylating Enzyme Rollen in der Verarbeitung polyubiquitinierte Proteine. Ubiquitination kann zu einer Veränderung der Stabilität des Proteins, zelluläre Lokalisation und biologischen Aktivität führen. Mutationen von Genen in die Ubiquitinierung / deubiquitination Weg oder verändert Ubiquitin-System-Funktion beteiligt sind, mit vielen verschiedenen Krankheiten wie verschiedene Arten von Krebs, Neurodegeneration und metabolischen Erkrankungen. Der Nachweis von veränderten oder normale Ubiquitinierung von Target-Proteinen kann zu einem besseren Verständnis der Pathogenese dieser Erkrankungen. Hier beschreiben wir Protokolle, um Protein-Ubiquitinierung in kultivierten Zellen erkennen

Protocol

Detektion von Protein-Ubiquitinierung in kultivierten Zellen

1. Transfizieren kultivierten Zellen mit Plasmiden, die das Protein exprimieren von Interesse und (Epitop-markierte Version von) Ubiquitin.
2. Machen Sie komplette Zell-Lyse-Puffer (2% SDS, 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0) mit 2 mM Natriumorthovanadat, 50 mM Natriumfluorid und Protease-Inhibitoren.
3. Lyse-Zellen mit 100 ul Zell-Lyse-Puffer pro Platte (6 cm Schale). Wenn eine größere Schüssel verwendet wird, die Lautstärke entsprechend an. Swirl den Teller vorsichtig, damit der Lyse-Puffer auf das gesamte Gebiet der gewachsenen Zellen.
4. Sammeln Sie die Zellen mit einem Zellschaber und übertragen Sie die Zelllysate in ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen. Das Röhrchen wird auf einer heißen Platte sofort für 10 min kochen.
5. Shear die Zellen mit einem Ultraschall-Gerät.
6. Add 900ul Verdünnungspuffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% Triton). Inkubieren Proben bei 4 ° C für 30-60 min mit Rotation.
7. Spin der verdünnten Proben bei 20.000 xg für 30 min. Übertragen Sie die resultierende Überstand in ein neues Eppendorf-Röhrchen. Achten Sie darauf, das Pellet stören.
8. Messen Sie die Protein-Konzentration.
9. Bereiten Protein A-oder G-Agarose Bead-konjugierten Antikörper gegen das Zielprotein in einem kompatiblen Puffer (50% iger Aufschwemmung). Schneiden Sie das schmale Ende eines P-200 Pipettenspitze und Transfer 14-20 ul von Harz zu 500-1.500 ug vorbereitet Zelllysaten für die Immunpräzipitation. Für Zellen mit hoher Transfektionseffizienz wird 500 ug genug sein. Für Zellen mit niedrigen Transfektionseffizienz kann mehr Protein benötigt wird.
10. Inkubieren Sie die Zelllysat-Bead-Gemisch bei 4 ° C über Nacht mit einer Rotation.
11. Spin down die Perlen bei 5000 xg für 5 min. Den Überstand aspirieren. Waschen Sie den Harz mit dem Waschpuffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40) zweimal.
12. Drehen Sie die Perlen für ein letztes Mal bei 20.000 xg für 30 sek. Saugen Sie die restlichen Waschpuffer und kochen das Harz mit 2X SDS-Ladepuffer.
13. Tragen Sie die Proben auf eine SDS-PAGE-Gel für Immunoblotting-Analyse.
14. Detect Ubiquitin und das Zielprotein mit entsprechenden Antikörpern. Für Immunoblot wir in der Regel erkennen Ubiquitin zuerst. Die Membran wird dann verwendet, um das Protein ausgefällt zu erkennen.

Erkennung von Ubiquitin auf Zielprotein durch In-vitro-Assay Ubiquitinierung

1. Machen 5X Ubiquitinierung Puffer (100 mM Tris-HCl, pH 7,5, 25 mM MgCl2, 2,5 mM DTT, 10 mM ATP). Lagern Sie sie in kleinen Portionen bei -20 ° C bis zu 6 Monate. Einige Protokolle auch hinzufügen, Kreatinphosphat und Kreatinkinase in den Puffer für die ATP-Regeneration ^1,2.
2. Für jede Reaktion vorzubereiten einer Mischung mit folgendem Inhalt:
   

   8 ul	5X Ubiquitinierung Puffer
   250 ng	Ubiquitinierung E1
   500 ng	Ubiquitinierung E2
   0,5 ug	Ubiquitin
   0,5 ug	Protein von Interesse
   	Wasser auf 40 ul Gesamtvolumen

   Als Kontrollen vorbereiten ähnliche Reaktionen in Abwesenheit von entweder E1, E2, oder Ubiquitin.
3. Inkubieren Sie die Mischung bei 37 ° C für 1 Stunde oder länger.
4. Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von SDS-PAGE-Probenpuffer und kochen die Probe für 10 min.
5. Tragen Sie die Proben auf SDS-PAGE-Gel für Immunoblotting-Analyse.
6. Detect Ubiquitin und das Zielprotein mit entsprechenden Antikörpern.

Discussion

In dieser Präsentation haben wir zum ersten Mal beschrieben Schritte, die Erkennung Ubiquitin Änderung auf ein Protein von Interesse in Säugetierzellen zu erlauben. Um Ubiquitinierung spezifisch nachzuweisen auf das Protein von Interesse, nicht auf nicht-kovalent interagierende Proteine, verwendeten wir eine stringente Bedingung für Zell-Lyse, Immunpräzipitation und Waschen ^1,3. Ubiquitination, durch Immunpräzipitation von Zielprotein in solch rauen Bedingungen durch Anti-Ubiquitin-Immunoblot gefolgt erkannt, ist daher wahrscheinlich, um genau zu sein, um das Zielprotein. Um zu verhindern, Protein deubiquitination während der experimentellen Verfahren kann deubiquitinating Enzym-Inhibitoren wie z. B. N-Ethylmaleimid und Ubiquitin Aldehyd, alle Puffer ⁴ hinzugefügt werden. Allerdings ist es unwahrscheinlich, dass die deubiquitination Enzyme aktiv bleiben nach 10 min Kochen Verfahren. Starke Abstriche oder Leitern von hochmolekularen Spezies sind in der Regel das Ergebnis der Ubiquitinierung. Der Grad der Ubiquitinierung des Proteins von Interesse kann durch den Vergleich des Verhältnisses von Ubiquitin / unmodifizierten Zielprotein in mehreren Experiment Bedingungen beurteilt werden. Inzwischen sind frei Ubiquitin-Moleküle in der Regel reduziert werden, wenn Ubiquitinierung von Zielprotein wird erhöht. Dieses Protokoll ist auch nützlich für andere Ubiquitin-like kleines Molekül Modifikation wie sumolyation und neddylation erkennen.

Wir haben auch beschrieben, ein in vitro Ubiquitinierung Assay unter Verwendung von gereinigten oder rekombinanten Proteinen. Verschiedene Epitop-markierten Ubiquitinierung Komponenten sind kommerziell erhältlich. Ubiquitination E3-Ligase ist nicht notwendig für Ubiquitin-Konjugation in vitro.