זיהוי של חלבון Ubiquitination

Summary

Ubiquitination הוא שינוי posttranslational המפתח בוצע על ידי קבוצה של שלושה אנזימים. מוטציות של גנים המעורבים שינוי זה קשור הרבה מחלות אנושיות שונות. כאן אנו מתארים פרוטוקולים לזהות ubiquitination החלבון בתאים בתרבית

Abstract

Ubiquitination, את הקובץ המצורף קוולנטיים של היוביקוויטין פוליפפטיד למקד חלבונים, הוא שינוי posttranslational המפתח בוצע על ידי קבוצה של שלושה אנזימים. הם כוללים היוביקוויטין, הפעלת אנזים E1, E2 היוביקוויטין-conjugating האנזים, האנזים E3 יוביקוויטין. בניגוד ל E1 ו E2, E3 המצע ligases היוביקוויטין סגוליות לתצוגה. מצד שני, אנזימים deubiquitylating יש תפקידים רבים בעיבוד חלבונים polyubiquitinated. Ubiquitination יכול לגרום לשינוי של יציבות חלבון, לוקליזציה הסלולר, ופעילות ביולוגית. מוטציות של גנים המעורבים במסלול ubiquitination / deubiquitination או תפקוד מערכת היוביקוויטין שינו המשויכים רבים מחלות אנושיות שונות, כגון סוגים שונים של סרטן, ניוון מוחיים, והפרעות מטבוליות. הגילוי של ubiquitination שינה או נורמלי של חלבונים היעד עשויה לספק הבנה טובה יותר על בפתוגנזה של מחלות אלה. כאן אנו מתארים פרוטוקולים לזהות ubiquitination החלבון בתאים בתרבית

Protocol

גילוי ubiquitination חלבון בתאים בתרבית

1. תאים בתרבית Transfect עם פלסמידים המבטאים את החלבון של עניין (epitope-tagged גרסה) יוביקוויטין.
2. הפוך את התא להשלים תמוגה חיץ (2% SDS, 150 mM NaCl, 10 mM טריס-HCl, pH 8.0) עם orthovanadate 2mm נתרן, נתרן פלואוריד 50 מ"מ, מעכבי פרוטאז.
3. Lyse תאים עם 100 חיץ תמוגה μl תא לכל צלחת (6 צלחת ס"מ). אם מנה גדולה יותר משמש, לכוון את עצמת השמע בהתאם. מערבולת התבשיל בזהירות לתת החיץ תמוגה לכסות את כל השטח של תאים בוגרים.
4. איסוף התאים עם מגרד תא ולהעביר את lysates תא לתוך צינור Eppendorf 1.5 מ"ל. מניחים את הצינור לצלחת חמה מיד לרתיחה 10 דקות.
5. שאר התאים עם מכשיר sonication.
6. הוסף 900ul של חיץ דילול (10 mM טריס-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, טריטון 1%). דגירה דגימות 4 מעלות צלזיוס במשך 30-60 דקות עם רוטציה.
7. ספין דגימות מדולל ב XG 20,000 למשך 30 דקות. מעבירים את supernatant שנוצר צינור Eppendorf חדש. היזהר לא להפריע גלולה.
8. למדוד את ריכוז החלבון.
9. הכינו חלבון או G-agarose חרוז מצומדות נוגדנים נגד חלבון המטרה במאגר תואם (50% slurry). חותכים את הקצה הצר של טיפ P-200 פיפטה ולהעביר 14-20 μl של שרף מיקרוגרם של 500-1,500 lysates תא מוכנים immunoprecipitation. עבור תאים עם נצילות גבוהה transfection, 500 מיקרוגרם יהיה מספיק. עבור תאים עם נצילות transfection נמוך, יותר חלבון עשוי להיות נחוץ.
10. דגירה את התערובת lysate-חרוז התא ב 4 ° C לילה עם רוטציה.
11. ספין למטה חרוזים XG ב 5000 עבור 5 דקות. לשאוב supernatant. שטפו את שרף עם למאגר כביסה (10 mM טריס-HCl, pH 8.0, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40) פעמיים.
12. ספין החרוזים בפעם האחרונה ב XG 20,000 למשך 30 שניות. לשאוב החיץ כביסה שיורית ומרתיחים שרף עם חיץ טעינת SDS 2X.
13. טען דוגמאות על ג'ל SDS עמודים עבור immunoblotting ניתוח.
14. זיהוי היוביקוויטין לבין חלבון המטרה עם נוגדנים בהתאמה. עבור immunoblotting, אנחנו בדרך כלל לזהות היוביקוויטין הראשון. הממברנה מכן ניתן יהיה להשתמש כדי לזהות את זירז חלבון.

זיהוי של חלבון המטרה ubiquitination על דרך ב assay ubiquitination חוץ גופית

1. הפוך את החיץ ubiquitination 5X (100 מ"מ טריס-HCl, pH 7.5, 25 מ"מ MgCl2, 2.5 מ"מ DTT, 10 mM ATP). אחסן אותם aliquots קטן -20 ° C עד חודש 6. פרוטוקולים מסוימים גם להוסיף פוספט קריאטין קריאטין קינז לתוך למאגר עבור ^1,2 התחדשות ATP.
2. עבור כל תגובה, להכין תערובת המכילה את הפעולות הבאות:
   

   Μl 8	Ubiquitination 5X חיץ
   250 ng	ubiquitination E1
   500 ng	ubiquitination E2
   0.5 מיקרוגרם	היוביקוויטין
   0.5 מיקרוגרם	חלבון עניין
   	נפח המים הכולל 40 μl

   כמו שולטת, להכין תגובות דומות בהעדר או E1, E2, או יוביקוויטין.
3. דגירה את התערובת על 37 מעלות צלזיוס למשך 1 שעה או יותר.
4. עצור את התגובה על ידי הוספת SDS-PAGE חיץ מדגם להרתיח את המדגם עבור 10 דקות.
5. טען דוגמאות על ג'ל SDS-PAGE עבור immunoblotting ניתוח.
6. זיהוי היוביקוויטין לבין חלבון המטרה עם נוגדנים בהתאמה.

Discussion

במצגת זו, אנו הראשון שתיאר צעדים המאפשרים לזהות שינוי יוביקוויטין על החלבון של עניין בתאי יונקים בתרבית. על מנת לזהות ubiquitination במיוחד על החלבון של עניין, לא על הלא קוולנטית חלבונים אינטראקציה, היינו מצב מחמירים עבור תמוגה התא, immunoprecipitation ושטיפת ^1,3. Ubiquitination, זוהה על ידי immunoprecipitation של חלבון המטרה במצב כזה קשה ואחריו immunoblotting אנטי היוביקוויטין, ולכן הוא עשוי להיות ספציפיים לחלבון היעד. כדי למנוע deubiquitination חלבון במהלך הפרוצדורות, מעכבי האנזים deubiquitinating כגון N-ethylmaleimide ו אלדהיד היוביקוויטין ניתן להוסיף כל ⁴ מאגרים. עם זאת, אין זה סביר כי האנזימים deubiquitination נשארים פעילים לאחר הניתוח 10 דקות רתיחה. מריחות חזקות או סולמות של מינים מולקולרי גבוה הם בדרך כלל תוצאה של ubiquitination. מידת ubiquitination של החלבון של עניין ניתן להעריך על ידי השוואת יחס של חלבון המטרה ubiquitinated / ללא שינוי בתנאי הניסוי מספר. בינתיים, מולקולות יוביקוויטין חינם מופחתים בדרך כלל כאשר ubiquitination של חלבון המטרה הוא גדל. פרוטוקול זה שימושי גם כדי לזהות שינויים אחרים היוביקוויטין כמו מולקולה קטנה כגון sumolyation ו neddylation.

אנחנו גם תיאר ב assay ubiquitination במבחנה באמצעות חלבונים מטוהרים או רקומביננטי. שונים epitope-tagged ubiquitination רכיבים זמינים מסחרית. האנזים E3 Ubiquitination אין צורך נטיה היוביקוויטין במבחנה.