Summary
Убиквитинирования является ключевым посттрансляционной модификации осуществляется набор из трех ферментов. Мутации генов, участвующих в этой модификации, связанные с различными заболеваниями человека. Здесь мы описываем протоколов для обнаружения белка убиквитинирования в культуре клеток
Abstract
Убиквитинирования, ковалентное присоединение полипептид убиквитин для белков-мишеней, является ключевым посттрансляционной модификации осуществляется набор из трех ферментов. Они включают в себя убиквитин-активации фермента E1, убиквитин-сопряжения фермент Е2, Е3 и убиквитин лигазы. В отличие от Е1 и Е2, Е3 лигазы убиквитин дисплей субстратной специфичности. С другой стороны, многочисленные deubiquitylating ферменты играют свою роль в обработке polyubiquitinated белков. Убиквитинирования может привести к изменению стабильность белков, клеточной локализации и биологической активности. Мутации генов, участвующих в убиквитинирования / deubiquitination путь или изменили убиквитин функции системы связаны с множеством различных заболеваний человека, таких как различные виды рака, нейродегенеративные, а также нарушения обмена веществ. Обнаружение измененной или нормальной убиквитинирования белков-мишеней может обеспечить лучшее понимание о патогенезе этих заболеваний. Здесь мы описываем протоколов для обнаружения белка убиквитинирования в культуре клеток
Protocol
Обнаружение белка убиквитинирования в культуре клеток
- Трансфекции культивируемых клеток с помощью плазмидов выражения белка процентов и (эпитоп с тегами версии) убиквитин.
- Сделайте полный буфер лизиса клеток (2% SDS, 150 мМ NaCl, 10 мМ Трис-HCl, рН 8,0) с 2 мМ ортованадата натрия, 50 мМ фторида натрия, и ингибиторы протеазы.
- Lyse клеток с 100 мкл буфера для лизиса клеток на чашку (6 см блюдо). Если большие блюда используется, регулировки громкости соответственно. Swirl блюдо тщательно, чтобы лизис буфера покрывают всю площадь выращиваемых клеток.
- Сбор клетки с клеткой скребком и передачи клеточных лизатов в 1,5 мл трубки Эппендорф. Место трубку на горячей плите сразу варить в течение 10 мин.
- Сдвиг клеток с ультразвуком устройства.
- Добавить 900ul разведения буфера (10 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 150 мМ NaCl, 2 мМ ЭДТА, 1% Тритон). Инкубируйте образцы при температуре 4 ° С в течение 30-60 мин с вращением.
- Спиновые разбавленные образцы на 20000 мкг в течение 30 мин. Передача в результате супернатант в новую пробирку Эппендорф. Будьте осторожны, чтобы не потревожить осадок.
- Мера концентрации белка.
- Подготовка Белки-или G-агарозы бусинка конъюгированных антител к белку-мишени в совместимом буфере (50% суспензии). Вырезать узкий конец P-200 пипетки и передачи 14-20 мкл смолы 500-1500 мкг подготовлены лизатов ячейки для иммунопреципитации. Для ячеек с высокой эффективностью трансфекции, 500 мкг будет достаточно. Для клеток с низкой эффективностью трансфекции, больше белка, могут быть необходимы.
- Инкубируйте Клеточный лизат-бусинка смесь при температуре 4 ° С в течение ночи с вращением.
- Спином вниз бисером при 5000 мкг в течение 5 мин. Аспирируйте супернатант. Вымойте смолы с промывочным буфером (10 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 1 М NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1% NP-40) в два раза.
- Спиновые бисером в последний раз на высоте 20000 мкг в течение 30 сек. Аспирируйте остаточной буфера стиральных и варить смолу с 2X буфером загрузки SDS.
- Нагрузка на образцы SDS-PAGE гель для иммуноблоттинга анализа.
- Обнаружение убиквитин и белка-мишени с соответствующими антителами. Для иммуноблоттинга, мы вообще обнаружить убиквитин в первую очередь. Мембрана будет использоваться для обнаружения белка в осадок.
Обнаружение убиквитинирования на белку-мишени путем анализа убиквитинирования В пробирке
- Сделать 5X буфера убиквитинирования (100 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 25 мМ MgCl2, 2,5 мМ DTT, 10 мМ АТФ). Положите их в небольшие аликвоты при -20 ° С до 6 месяцев. Некоторые протоколы также добавить креатинфосфата и креатинкиназы в буфер за 1,2 регенерация АТФ.
- Для каждой реакции, готовить смесь, содержащая следующее:
В качестве контроля, подготовки подобных реакций в условиях отсутствия или E1, E2, или убиквитин.8 мкл 5X буфера убиквитинирования 250 нг убиквитинирования E1 500 нг убиквитинирования E2 0,5 мкг убиквитин 0,5 мкг белок воды до 40 мкл общего объема - Выдержите смесь при температуре 37 ° С в течение 1 часа или дольше.
- Остановить реакцию добавлением SDS-PAGE образца буфера и варить образца в течение 10 мин.
- Нагрузка на образцы SDS-PAGE гель для иммуноблоттинга анализа.
- Обнаружение убиквитин и белка-мишени с соответствующими антителами.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой презентации мы впервые описаны шаги, которые позволяют обнаружения убиквитин модификации на белок в культивируемых клетках млекопитающих. С целью выявления убиквитинирования именно на белок, а не на нековалентно белки взаимодействуют, мы использовали жесткое условие для лизиса клеток, иммунопреципитации и стиральные 1,3. Убиквитинирования, обнаружены иммунопреципитации целевого белка в таких суровых условиях последующей анти-убиквитин иммуноблоттинга, поэтому, вероятно, будут специфичны для целевого белка. Для предотвращения белка deubiquitination во время экспериментальных процедур, deubiquitinating ингибиторы ферментов, таких как N-ethylmaleimide и убиквитин альдегид могут быть добавлены к все буферы 4. Тем не менее, маловероятно, что deubiquitination ферменты остаются активными после 10 минут кипения процедуры. Сильные мазки или лестницы с высокой молекулярной видов, как правило, результат убиквитинирования. Степень убиквитинирования белка интереса можно оценить, сравнивая отношение ubiquitinated / немодифицированной целевого белка в нескольких условий эксперимента. Между тем, свободный убиквитин молекулы, как правило, снижается, когда убиквитинирования целевого белка увеличивается. Этот протокол также полезен для обнаружения других убиквитин-как небольшая модификация молекулы, такие как sumolyation и neddylation.
Мы также описаны в пробирке убиквитинирования методом с использованием очищенной или рекомбинантных белков. Различные эпитопа с метками компонентов убиквитинирования имеются в продаже. Лигазы убиквитинирования Е3 не является необходимым для убиквитин сопряжения в пробирке.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами NIH RO1 DC006497, RO1 NS057289 и PO1 ES016738 (до Z. Zhang); Калифорнийского института регенеративной медицины гранты RS1-00331-1 и RL1-00682-1 (до Z. Zhang), американский Паркинсона Болезнь ассоциации (до Я. Чжан и Ю. С. Чу) и Майкл Дж. Фокс Фонд исследований Паркинсона (Z. Zhang).
References
- Xiong, H. PINK1, and DJ-1 form a ubiquitin E3 ligase complex promoting unfolded protein degradation. J Clin Invest. 119, 650-660 (2009).
- Xirodimas, D. P., Saville, M. K., Bourdon, J. C., Hay, R. T., Lane, D. P. Mdm2-mediated NEDD8 conjugation of p53 inhibits its transcriptional activity. Cell. 118, 83-97 (2004).
- Didier, C. RNF5, a RING finger protein that regulates cell motility by targeting paxillin ubiquitination and altered localization. Mol Cell Biol. 23, 5331-5345 (2003).
- Laney, J. D., Hochsetrasser, M. Unit 14.5 Analysis of Protein Ubiquitination. Current Protocols in Protein Science. , 14.5.1-14.5.11 (2002).
