La detección de ubiquitinación de proteínas

Summary

Ubiquitinación es una modificación postraduccional clave llevadas a cabo por un conjunto de tres enzimas. Las mutaciones de los genes implicados en esta modificación se asocian con muchas enfermedades humanas diferentes. Aquí se describen los protocolos para detectar la ubiquitinación de proteínas en las células cultivadas

Abstract

Ubiquitinación, la unión covalente de la ubiquitina polipéptido que se dirigen a proteínas, es una modificación postraduccional clave llevadas a cabo por un conjunto de tres enzimas. Estos incluyen la activación de la enzima ubiquitina E1, E2 ubiquitina-conjugación enzima, y ​​E3 ubiquitina ligasa. A diferencia de E1 y E2, E3 ubiquitina ligasas pantalla especificidad de sustrato. Por otro lado, numerosas enzimas deubiquitylating tienen un papel en el procesamiento de las proteínas polyubiquitinated. Ubiquitinación puede resultar en un cambio de la estabilidad de las proteínas, localización celular y la actividad biológica. Las mutaciones de los genes implicados en la vía de ubiquitinación / deubiquitination o alteración de la función del sistema ubiquitina están asociados con muchas enfermedades diferentes humanos, tales como varios tipos de cáncer, neurodegeneración, y trastornos metabólicos. La detección de ubiquitination alterado o normal de las proteínas diana pueden proporcionar una mejor comprensión de la patogénesis de estas enfermedades. Aquí se describen los protocolos para detectar la ubiquitinación de proteínas en las células cultivadas

Protocol

La detección de la ubiquitinación de proteínas en las células cultivadas

1. Transfectar células cultivadas con plásmidos que expresan la proteína de interés y (epítopo de etiquetado de la versión) ubiquitina.
2. Hacer búfer completo lisis celular (2% SDS, 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0) con ortovanadato de sodio 2 mM, 50 mM de fluoruro de sodio, y los inhibidores de la proteasa.
3. Lisis de las células con 100 l buffer de lisis celular por placa (6 cm plato). Si un plato más grande se utiliza, ajustar el volumen en consecuencia. Agite el plato con cuidado para que el tampón de lisis cubrir toda el área de las células cultivadas.
4. Recoger las células con un rascador de células y la transferencia de los lisados ​​de células en un tubo eppendorf de 1,5 ml. Coloque el tubo en un plato caliente de inmediato a hervir durante 10 minutos.
5. Shear las células con un dispositivo de ultrasonidos.
6. Añadir 900ul de buffer de dilución (10 Triton mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1%). Incubar las muestras a 4 ° C durante 30-60 minutos con la rotación.
7. Girar las muestras diluidas a 20.000 xg durante 30 min. Transferir el sobrenadante resultante a un nuevo tubo eppendorf. Tenga cuidado de no perturbar el sedimento.
8. Medir la concentración de proteínas.
9. Prepare la proteína A o G-agarosa bolas conjugado de anticuerpos contra la proteína de interés en un buffer compatible (50% de lodo). Corte el extremo estrecho de una punta de pipeta P-200 y la transferencia de 14 a 20 l de resina de 500-1.500 mg de lisados ​​celulares preparados para inmunoprecipitación. Para las células con una eficiencia de transfección de alto, 500 mg será suficiente. Para las células con una eficiencia de transfección de baja, más proteínas puede ser necesario.
10. Se incuban las células lisado de perlas mezcla a 4 ° C durante la noche con la rotación.
11. De girar las bolas a 5000 xg durante 5 min. Aspirar el sobrenadante. Lavar la resina con la solución de lavado (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40) dos veces.
12. Girar las cuentas por última vez a 20.000 xg durante 30 segundos. Aspirar la solución de lavado residual y hervir la resina con tampón de carga 2X SDS.
13. Cargar las muestras en un gel de SDS-PAGE para el análisis de inmunotransferencia.
14. Detectar la ubiquitina y la proteína diana con anticuerpos respectivos. Por immunoblotting, por lo general, detectar la ubiquitina en primer lugar. La membrana entonces se utiliza para detectar la proteína precipitada.

La detección de la ubiquitinación de las proteínas diana a través de En el ensayo in vitro ubiquitinación

1. Hacer buffer ubiquitinación 5X (100 mM Tris-HCl, pH 7,5, 25 mM MgCl2, 2,5 mM de DTT, 10 mM ATP). Guárdelos en pequeñas alícuotas a -20 ° C hasta por 6 meses. Algunos protocolos también añadir el fosfato de creatina y la creatina quinasa en el buffer de ATP ^1,2 regeneración.
2. Para cada reacción, prepare una mezcla que contiene lo siguiente:
   

   L 8	Buffer ubiquitinación 5X
   250 ng	ubiquitinación E1
   500 ng	ubiquitinación E2
   0,5 mg	ubiquitina
   0,5 mg	proteína de interés
   	agua a 40 l volumen total

   Como controles, preparar reacciones similares en la ausencia de cualquiera de E1, E2, o ubiquitina.
3. Incubar la mezcla a 37 ° C durante 1 hora o más.
4. Detener la reacción mediante la adición de SDS-PAGE muestra de amortiguación y hervir la muestra durante 10 minutos.
5. Cargar las muestras en gel SDS-PAGE para el análisis de inmunotransferencia.
6. Detectar la ubiquitina y la proteína diana con anticuerpos respectivos.

Discussion

En esta presentación, lo primero que describió las medidas que permitan detectar modificaciones ubiquitina a una proteína de interés en los cultivos de células de mamíferos. Con el fin de detectar la ubiquitinación específicamente en la proteína de interés, no en las proteínas que interactúan de forma no covalente, se utilizó una condición estricta para la lisis celular, inmunoprecipitación y el lavado de ^1,3. Ubiquitinación, detectado por inmunoprecipitación de la proteína diana en un estado severo seguido de anti-ubiquitina inmunotransferencia, pues, es probable que se específica a la proteína diana. Para evitar deubiquitination proteínas durante los procedimientos experimentales, deubiquitinating inhibidores de la enzima como la N-etilmaleimida y aldehído ubiquitina puede ser añadido a todos los búferes de ^4. Sin embargo, es poco probable que las enzimas deubiquitination permanecen activos después de la intervención de 10 minutos de ebullición. Frotis fuertes o escaleras de especies de alto molecular son generalmente el resultado de ubiquitinación. El grado de ubiquitinación de la proteína de interés puede ser evaluado mediante la comparación de la proporción de proteína diana ubiquitinadas / sin modificaciones en las condiciones del experimento varias. Mientras tanto, libre de moléculas de ubiquitina se reduce generalmente cuando la ubiquitinación de la proteína diana es mayor. Este protocolo también es útil para detectar otras ubiquitina-como la modificación de moléculas pequeñas como sumolyation y neddylation.

También se describe un ensayo in vitro utilizando ubiquitinación proteínas purificadas o recombinantes. Varios epítopo de etiquetado los componentes de ubiquitinación están disponibles comercialmente. Ligasa E3 ubiquitinación no es necesario para la conjugación de la ubiquitina in vitro.