Rilevamento di proteine ​​Ubiquitinazione

Summary

Ubiquitinazione è una modificazione post-traslazionale chiave svolto da una serie di tre enzimi. Le mutazioni di geni coinvolti in questa modifica sono associati a diverse malattie umane. Qui, descriviamo i protocolli per rilevare ubiquitinazione delle proteine ​​in cellule in coltura

Abstract

Ubiquitinazione, l'attacco covalente del ubiquitina polipeptide a bersaglio le proteine, è una modificazione post-traslazionale chiave svolto da una serie di tre enzimi. Essi comprendono l'attivazione di enzimi ubiquitina-E1, ubiquitina-coniugando enzima E2 ed E3 ubiquitina ligasi. A differenza di E1 ed E2, E3 ubiquitina ligasi visualizzare specificità di substrato. D'altra parte, numerosi enzimi deubiquitylating hanno un ruolo nella trasformazione delle proteine ​​polyubiquitinated. Ubiquitinazione può risultare in cambio di stabilità proteica, localizzazione cellulare, e l'attività biologica. Le mutazioni di geni coinvolti nella ubiquitinazione / deubiquitination percorso o alterata funzione del sistema ubiquitina sono associati a molte malattie umane come vari tipi di cancro, neurodegenerazione e disordini metabolici. Il rilevamento di ubiquitinazione alterata o normale di proteine ​​bersaglio può fornire una migliore comprensione della patogenesi di queste malattie. Qui, descriviamo i protocolli per rilevare ubiquitinazione delle proteine ​​in cellule in coltura

Protocol

Rilevazione di ubiquitinazione delle proteine ​​in cellule in coltura

1. Trasfettare cellule in coltura con i plasmidi che esprimono la proteina di interesse e (epitopo-tagged versione) ubiquitina.
2. Di dare integrale buffer di lisi cellulare (2% SDS, 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0) con orthovanadate sodio 2mM, 50 mM fluoruro di sodio, e gli inibitori della proteasi.
3. Lisare le cellule con 100 microlitri di buffer lisi cellulare per piastra (6 piatto cm). Se una parabola più grande viene utilizzato, regolare il volume di conseguenza. Agitare il piatto con attenzione per lasciare che il tampone di lisi coprire l'intera area di cellule coltivate.
4. Raccogliere le cellule con un raschietto cellulare e trasferire i lisati di cellule in una provetta eppendorf da 1,5 ml. Posizionare il tubo su una piastra calda subito a bollire per 10 minuti.
5. Taglio le cellule con un dispositivo di sonicazione.
6. Aggiungi 900ul di tampone di diluizione (10 Triton mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1%). Incubare i campioni a 4 ° C per 30-60 min con rotazione.
7. Spin i campioni diluiti a 20.000 xg per 30 min. Trasferire il surnatante risultante in una nuova provetta Eppendorf. Fare attenzione a non disturbare il pellet.
8. Misurare la concentrazione di proteine.
9. Preparare proteina A o G-agarosio tallone coniugato anticorpi contro la proteina bersaglio in un buffer compatibile (50% liquami). Tagliare la parte più stretta di una punta P-200 pipetta e trasferire 14-20 ml di resina 500-1,500 mcg di lisati cellulari preparato per immunoprecipitazione. Per le celle con efficienza di transfezione alta, 500 mcg sarà sufficiente. Per le celle con efficienza di trasfezione bassa, più proteine ​​possono essere necessari.
10. Incubare il lisato-tallone miscela di cellule a 4 ° C per una notte con rotazione.
11. Spin giù le perline a 5000 xg per 5 min. Aspirare il sopranatante. Lavare la resina con il tampone di lavaggio (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40) due volte.
12. Spin le perle per l'ultima volta a 20.000 xg per 30 sec. Aspirare il tampone residuo di lavaggio e far bollire la resina con tampone 2X carico SDS.
13. Caricare campioni su un gel SDS-PAGE per l'analisi immunoblotting.
14. Rileva ubiquitina e la proteina bersaglio con anticorpi rispettivi proprietari. Per immunoblotting, in genere rilevare ubiquitina prima. La membrana sarà poi utilizzata per rilevare la proteina precipitata.

Rilevamento di ubiquitinazione sulla proteina bersaglio attraverso Saggio in vitro ubiquitination

1. Fai tampone 5X ubiquitinazione (100 mM Tris-HCl, pH 7,5, 25 mM MgCl2, 2,5 mM DTT, 10 mM ATP). Memorizzarli in piccole aliquote a -20 ° C fino a 6 mesi. Alcuni protocolli anche aggiungere creatina fosfato e di creatin-chinasi nel buffer di ^1,2 ATP rigenerazione.
2. Per ogni reazione, preparare una miscela contenente quanto segue:
   

   8 microlitri	Ubiquitination tampone 5X
   250 ng	ubiquitination E1
   500 ng	ubiquitination E2
   0,5 mcg	ubiquitina
   0,5 mcg	proteina di interesse
   	acqua a 40 microlitri di volume totale

   Come controlli, preparare reazioni simili in mancanza di uno E1, E2, o ubiquitina.
3. Incubare la miscela a 37 ° C per 1 ora o più.
4. Arrestare la reazione aggiungendo SDS-PAGE tampone campione e fate bollire il campione per 10 min.
5. Caricare i campioni sul gel SDS-PAGE per l'analisi immunoblotting.
6. Rileva ubiquitina e la proteina bersaglio con anticorpi rispettivi proprietari.

Discussion

In questa presentazione, abbiamo prima descritto passi che permettono di rilevare la modifica ubiquitina su una proteina di interesse in colture di cellule di mammifero. Al fine di rilevare l'ubiquitinazione in particolare sulla proteina di interesse, non su non covalente delle proteine ​​che interagiscono, abbiamo usato una condizione rigorosi per la lisi cellulare, immunoprecipitazione e lavaggio ^1,3. Ubiquitinazione, rilevato da immunoprecipitazione della proteina bersaglio in una condizione dura seguita da anti-ubiquitina immunoblotting, è quindi probabile che sia specifico per la proteina bersaglio. Per evitare deubiquitination proteina durante le procedure sperimentali, inibitori dell'enzima deubiquitinating come N-ethylmaleimide e aldeide ubiquitina può essere aggiunto a tutti i buffer ^4. Tuttavia, è improbabile che gli enzimi deubiquitination rimanere attivo dopo 10 min procedura bollente. Strisci forte o scale di alta specie molecolari sono in genere il risultato di ubiquitinazione. Il grado di ubiquitinazione della proteina di interesse può essere valutata confrontando il rapporto tra proteina bersaglio ubiquinate / non modificati in condizioni sperimentali diverse. Nel frattempo, libero molecole ubiquitina sono generalmente ridotti quando ubiquitinazione della proteina bersaglio è aumentato. Questo protocollo è utile anche per rilevare altri ubiquitina-come piccola modifica molecola come sumolyation e neddylation.

Abbiamo anche descritto un test in vitro utilizzando ubiquitinazione proteine ​​purificate o ricombinanti. Vari epitopo-tagged componenti ubiquitinazione sono disponibili in commercio. E3 ligasi ubiquitinazione non è necessario per coniugazione dell'ubiquitina in vitro.