蛋白泛素化的检测

Summary

泛素化是一个关键的三种酶进行转录后修饰。在此修改有关的基因突变与许多不同的人类疾病。在这里，我们描述了协议检测培养细胞中的蛋白质的泛素

Abstract

泛素化，多肽靶蛋白的泛素共价结合，是一个重要的三种酶进行转录后修饰。它们包括泛素激活酶E1，泛素结合酶E2和泛素连接酶E3。不同于以E1和E2，E3泛素连接酶显示底物特异性。另一方面，众多deubiquitylating酶处理polyubiquitinated蛋白质的作用。泛素蛋白的稳定性，细胞定位及生物活性的变化可能导致。在参与泛素/ deubiquitination途径或系统功能改变泛的基因突变与许多不同的人类疾病，如癌症，神经退行性疾病和代谢性疾病，各类。改变或正常靶蛋白的泛素化的检测可能会提供一个更好地了解这些疾病的发病机制。在这里，我们描述了协议检测培养细胞中的蛋白质的泛素

Protocol

在培养细胞中检测蛋白的泛素化

1. 与表达的蛋白（抗原表位标签的版本）泛的质粒转染培养细胞。
2. 请完整的细胞裂解液（2％十二烷基硫酸钠，氯化钠150毫米，10毫米的Tris - HCl，pH值8.0）2MM钒酸钠，50毫米氟化钠，和蛋白酶抑制剂。
3. 裂解细胞，每盘100μL细胞裂解液（6厘米菜）。如果使用一个更大的盘，相应地调整音量。仔细旋流菜让裂解液覆盖整个区域的细胞生长。
4. 与细胞刮刀收集细胞和细胞裂解液转移到1.5 mL Eppendorf管。管放置到一个热点板块，立即煮沸10分钟。
5. 剪切细胞与超声设备。
6. 加入900ul稀释缓冲液（10毫米的Tris - HCl，pH值8.0，氯化钠150毫米，2毫米EDTA，1％的Triton）。在4 ° C孵育30-60分钟与旋转样品。
7. 在20,000 30分钟XG的旋转稀释样品。导致上清转移到一个新的Eppendorf管。要小心不要去打扰颗粒。
8. 测定蛋白浓度。
9. 准备对一个或G琼脂糖珠共轭抗体在兼容的缓冲液（50％浆）的目标蛋白的蛋白质。切窄的一端和一个P - 200枪头14-20树脂液转移到500-1,500微克准备的免疫细胞裂解液。细胞转染效率高，500微克就足够了。对于细胞的转染效率低，可能需要更多的蛋白质。
10. 在4 ° C过夜旋转培养的细胞裂解液珠的混合物。
11. 离心5分钟在5000 XG珠。吸出上清液。洗净树脂洗涤缓冲液（10毫米的Tris - HCl，pH值8.0，1 M氯化钠，1毫米EDTA，1％NP - 40）的两倍。
12. 旋转作最后一次为30秒20,000 XG珠。吸残留的洗涤液和2X SDS上样缓冲液煮沸的树脂。
13. 装载到SDS - PAGE凝胶免疫分析的样品。
14. 检测泛素和相应的抗体与靶蛋白。对于免疫印迹，我们一般先检测泛素。膜会被用来检测蛋白质的沉淀。

在体外泛素化实验检测靶蛋白通过泛素化

1. 设为5X泛素化缓冲液（100毫米的Tris - HCl，pH值7.5，25毫米氯化镁，数码地面电视的2.5毫米，10毫米ATP）。储存在-20 ° C长达6个月的小等分。有些协议也添加到缓冲区ATP再生^1,2磷酸肌酸和肌酸磷酸激酶。
2. 对于每一个反应，准备的混合物，包含以下内容：
   

   8μL	5X泛素缓冲区
   250吴	泛素E1
   500吴	泛素E2
   0.5微克	泛
   0.5微克	蛋白质的利益
   	水至40μL总体积

   作为对照，无论是E1，E2或泛的情况下，准备在类似的反应。
3. 混合物在37℃，1小时或更长的时间。
4. 加入SDS - PAGE样品缓冲液停止反应，煮沸10分钟的样品。
5. 加载到SDS - PAGE电泳，免疫印迹分析的样品。
6. 检测泛素和相应的抗体与靶蛋白。

Discussion

在此演示中，我们首先描述的步骤，允许检测的兴趣培养的哺乳动物细胞中的蛋白质的泛素修饰。为了检测蛋白质的利益，不会对非共价键相互作用的蛋白质，泛素化，特别是，我们用一个严格的条件下裂解细胞，免疫沉淀和^洗涤 1,3 。泛素化，反泛素免疫印迹在这样一个苛刻的条件的目标蛋白的免疫检测，因此可能是特定目标蛋白质。为了防止在实验过程中的蛋白质deubiquitination， 如 N - ethylmaleimide和泛醛酶抑制剂deubiquitinating可能被添加到所有^的缓冲区4。然而，这是不太可能的，煮沸10分钟后程序deubiquitination酶保持活跃。强涂片或分子高的梯子，是典型的泛素化的结果。感兴趣的蛋白质的泛素化程度，可以在几个实验条件下通过比较靶蛋白泛素/未修改的比例分摊。同时，自由的泛素分子一般都减少了，当靶蛋白的泛素化是增加。这个协议也是有用的检测泛素样小分子修饰，如sumolyation和neddylation。

我们还介绍了使用纯化或重组蛋白在体外泛素化检测。不同的抗原表位标签的泛素化组件均为市售。泛素E3连接酶是没有必要在体外泛素共轭。