단백질 Ubiquitination의 감지

Summary

Ubiquitination 세 효소의 집합으로 실시하는 핵심 posttranslational 수정합니다. 이 수정에 관여 유전자의 돌연변이가 여러 가지 인간의 질병와 관련된 있습니다. 여기, 우리는 교양 세포에 단백질 ubiquitination을 감지 프로토콜 설명

Abstract

Ubiquitination, 단백질을 타겟으로 polypeptide ubiquitin의 공유 결합 첨부 파일 세 효소의 집합으로 실시하는 핵심 posttranslational 수정합니다. 그들은 ubiquitin - 활성화 효소 E1, ubiquitin - 결합 효소 E2, 그리고 ubiquitin ligase의 E3를 포함합니다. E1과 E2, E3 ubiquitin ligases 디스플레이 기판 특이성을 달리. 한편, 수많은 deubiquitylating 효소는 polyubiquitinated 단백질을 처리하는 역할을합니다. Ubiquitination 단백질의 안정성, 휴대 현지화, 그리고 생물 학적 활동의 변화가 발생할 수 있습니다. ubiquitination / deubiquitination 경로 또는 변경 ubiquitin 시스템 기능에 관련된 유전자의 돌연변이 같은 암, neurodegeneration, 그리고 신진 대사 장애의 다양한 유형으로 다양한 인간 질환과 관련된 있습니다. 대상 단백질의 변경 또는 정상 ubiquitination의 감지는 이러한 질병의 pathogenesis에 대한 더 나은 이해를 제공할 수 있습니다. 여기, 우리는 교양 세포에 단백질 ubiquitination을 감지 프로토콜 설명

Protocol

교양 세포에서 단백질의 ubiquitination 검색

1. 관심 단백질과 (에피토프 - 태그의 버전) ubiquitin을 표현 plasmids와 Transfect 교양 세포.
2. 전체 세포 용해 완충액 (2 % SDS, 150 MM NaCl, 10 MM 트리스 - HCL, pH를 8.0) 2mM 나트륨 orthovanadate, 50 MM 나트륨 불화, 그리고 프로 테아제 억제제와 함께.하십시오
3. 접시 당 100 μl 세포 용해 완충액 (6cm 요리)와 세포를 Lyse. 큰 접시를 사용하는 경우, 적절하게 볼륨을 조절할 수 있습니다. 소용돌이는 음식을 신중하게 용해 버퍼가 성장 세포의 전체 영역을 커버하도록.
4. 휴대 스크레이퍼로 세포를 수집하고 1.5 ML eppendorf 튜브에 세포 lysates를 전송할 수 있습니다. 10 분 끓인 즉시 뜨거운 접시에 튜브를 놓습니다.
5. sonication 장치와 전단은 세포.
6. 희석 버퍼의 900ul (10 MM 트리스 - HCL, pH를 8.0, 150 MM NaCl, 2 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1 %의 트리톤) 추가합니다. 회전 30-60 분 4 ° C에서 샘플을 품어.
7. 30 분 20,000 XG에서 희석 샘플을 스핀. 새로운 eppendorf 튜브에 뜨는 결과를 전송합니다. 펠렛을 방해하지 않도록주의하십시오.
8. 단백질 농도를 측정.
9. 호환 버퍼 (50 % 슬러리)의 목표 단백질에 대한 단백질 또는 G - 아가로 오스 비드 - 복합 항체를 준비합니다. P - 200 피펫 팁의 좁은 끝을 잘라 immunoprecipitation을위한 준비 세포 lysates의 500-1,500 μg에 수지 14-20 μl를 전송합니다. 높은 transfection 효율과 전지, 500 μg 충분합니다. 낮은 transfection 효율 세포에 대한 더 많은 단백질이 필요합니다.
10. ° C 하룻밤 회전 4 셀 lysate - 비드 혼합물을 품어.
11. 5 분 5,000 XG에 비즈를 스핀 다운. 뜨는을 대기음. 세탁 버퍼 (10 MM 트리스 - HCL, pH를 8.0, 1 M NaCl, 1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1 % NP - 40)가 두 번있는 수지를 씻으십시오.
12. 30 초에 대한 20,000 XG에서 마지막 시간 동안 비즈를 스핀. 잔여 세척 버퍼를 기음과 2X SDS 로딩 버퍼와 수지를 끓여.
13. 분석 immunoblotting에 대한 SDS - PAGE 젤로 샘플을로드합니다.
14. 각각의 항체와 ubiquitin과 대상 단백질 감지. immunoblotting을 위해, 우리는 일반적으로 첫번째 ubiquitin 감지합니다. 막은 다음 단백질 시켰던를 감지하는 데 사용됩니다.

체외의 ubiquitination 분석을 통해 대상 단백질의 ubiquitination의 감지

1. 배 ubiquitination 버퍼를 (100 MM 트리스 - HCL, pH를 7.5, 25 MM MgCl2, 2.5 MM DTT, 10 MM ATP)합니다. 최대 6 개월에 대해 -20 ° C에서 작은 aliquots에 저장합니다. 일부 프로토콜은 또한 ATP 재생 ^1,2에 대한 버퍼로 크레아틴 인산염과 크레아틴 키나제를 추가합니다.
2. 각 반응은 다음을 포함하는 혼합물을 준비 :
   

   μl 8	배 ubiquitination 버퍼
   250 NG	ubiquitination E1
   500 NG	ubiquitination E2
   0.5 μg	ubiquitin
   0.5 μg	관심 단백질
   	40 μl 전체 볼륨을 물

   컨트롤로, E1, E2, 또는 ubiquitin 중의 부재에서 유사한 반응을 준비합니다.
3. ° C 1시간 이상 37 혼합물을 품어.
4. SDS - PAGE 샘플 버퍼를 추가하여 반응을 중지하고 10 분에 대한 샘플을 끓여.
5. 분석 immunoblotting에 대한 SDS - PAGE 젤로 샘플을로드합니다.
6. 각각의 항체와 ubiquitin과 대상 단백질 감지.

Discussion

이 프레 젠 테이션에서, 우리가 처음 교양 포유 동물 세포에 대한 관심의 단백질에 ubiquitin 수정을 감지 허가 단계를 설명했다. 하지 않은 covalently 상호 작용하는 단백질에 대한 관심의 단백질에 특별히 ubiquitination를 감지하기 위해, 우리는 세포 용해, immunoprecipitation과 ^{1,3 세척을위한} 엄격한 조건을 사용합니다. 안티 ubiquitin immunoblotting 다음과 같은 거친 상태로 표적 단백질의 immunoprecipitation 감지 Ubiquitination은, 따라서 대상 단백질에 구체적으로 가능성이 높습니다. 실험 절차 중에 단백질 deubiquitination을 방지하기 위해, 같은 N - ethylmaleimide과 ubiquitin 알데히드와 같은 deubiquitinating 효소 억제제는 모든 버퍼 ⁴ 추가할 수 있습니다. 그러나, 그것은 deubiquitination 효소는 10 분 끓는 절차 후에 활성 상태로 유지 않을 수도 있습니다. 높은 분자 종의 강력한 얼룩이나 사다리 일반적으로 ubiquitination의 결과입니다. 관심의 단백질의 ubiquitination의 정도는 여러 가지 실험 조건에서 ubiquitinated / 수정되지 않은 대상 단백질의 비율을 비교하여 평가하실 수 있습니다. 대상 단백질의 ubiquitination이 증가되었을 때 한편, 무료 ubiquitin 분자는 일반적으로 감소합니다. 이 프로토콜은 또한 sumolyation 및 neddylation 같은 다른 ubiquitin과 같은 작은 분자 수정을 감지하는 데 유용합니다.

우리는 또한 정화 또는 재조합 단백질을 사용하여 체외의 ubiquitination 분석에서 설명했다. 다양한 에피토프 - 태그 ubiquitination 구성 요소는 상업적으로 사용할 수 있습니다. Ubiquitination의 E3 ligase의가 체외에서 ubiquitin 활용을 위해 필요하지 않습니다.