Gravações da ativação do circuito neural no Livremente Behaving Animais

Summary

Medidas não invasivas de padrões de atividade neural em animais livremente comportando são obtidos através da combinação de gravações neurofisiológicos com videografia de alta velocidade.

Abstract

A relação entre padrões de atividade neural e expressão comportamental correspondente é difícil estabelecer em animais desenfreada. Tradicionais métodos não-invasivos requerem sujeitos de pesquisa, pelo menos parcialmente contido, e eles só permitem a identificação de um grande número de neurônios ativados simultaneamente. Por outro lado, pequenos conjuntos de neurônios ou neurônios individuais só podem ser medidos usando uma única célula gravações obtidas a partir de preparações em grande parte reduzida. Uma vez que a expressão do comportamento natural é limitada em animais contido e dissecados, os mecanismos neurais subjacentes que controlam esse tipo de comportamento são difíceis de identificar.

Aqui, eu apresento uma técnica não-invasiva fisiológico que permite a medição de ativação de circuitos neurais em animais se comportando livremente. Usando um par de eletrodos de arame dentro de uma câmara cheia de água, os eletrodos banho de captação de potenciais de campo neural e muscular gerado por lagostas juvenis durante as respostas de fuga natural ou experimentalmente evocado. As respostas de fuga primária de lagostas são mediadas por três diferentes tipos de rabo-flips que se movem os animais longe do ponto de estimulação. Cada tipo de rabo-flip é controlado pelo seu próprio circuito neural; as duas respostas de fuga mais rápido e potente requer ativação de diferentes conjuntos de neurônios de comando de grandes dimensões. Em combinação com as observações comportamentais, as gravações eletrodo banho de permitir a identificação inequívoca destes neurônios e os circuitos associados neural. Assim, a atividade dos circuitos neurais subjacentes ao comportamento natural pode ser medida em animais e irrestrita em diferentes contextos comportamentais.

Protocol

Parte 1: Câmara de gravação

1. A câmara de gravação é de forma retangular e é feito de vidro com paredes finas. Câmara dimensões são 8,5 cm x 2 cm x 5 cm (comprimento x largura x altura) para animais de 2,5-3,5 centímetros comprimentos total (medido a partir rostro até telson).
   Ver fig. 1 para um exemplo de uma câmara utilizada em nossos experimentos.
2. Alternativamente, as câmaras de gravação pode ser feita a partir de outros materiais (por exemplo, de plástico atóxico transparente). Chambers tamanho pode variar de acordo com o procedimento experimental e câmaras deve ser personalizado para cada série experimental. Para melhores resultados, tamanho da câmara deve ser tão pequena quanto possível, sem restringir os animais em seu comportamento natural. Como regra geral, os comprimentos e largura da câmara não deve ser superior a três vezes o tamanho do animal.

Parte 2: eletrodos Bath e fio terra

1. Um par de eletrodos de registro e um eletrodo terra são utilizados. Eletrodos são feitos de fio de cobre isolado (26 AWG com isolamento 0,25 mm). Uma das extremidades dos eletrodos banho é conectado a um amplificador extracelular (AM Sistemas de 1700; veja abaixo) e 0,5-1,0 mm de isolamento são tirou a outros fins. O fio terra está ligado ao aterramento do amplificador ou qualquer outro equipamento aterrado e 2-3 cm de isolamento é retirada do outro lado.
2. Eletrodos de banho e fio-terra são presos às paredes interior da câmara gravando com cola não tóxica. Eletrodos de registro são posicionados centralmente em ambos os lados curtos da câmara e em frente ao outro (Fig. 1).
3. Eletrodo terra está posicionado em um lado comprido da câmara de gravação perpendicular aos eletrodos de gravação (Fig. 1).
4. Câmara está cheia com água deionizada. Melhores resultados são obtidos com água de alta resistência (~ 18 mohms).

Parte 3: gravações eletrodo Bath

1. Saídas de eletrodos de registro são amplificados (1000x) por um amplificador extracelular (AM Sistemas; Modelo 1700). Sinal do eletrodos de registro é filtrado usando uma combinação de baixa freqüência (<100 Hz) e alta freqüência de corte (> 5 kHz). Sinal é então ligado a uma caixa de comutação e uma placa de aquisição de dados (National Instruments). Dados digitalizados é gravado, armazenados e analisados ​​utilizando dados de aquisição de software (Ferramentas Photron Motion).
2. Alternativamente, o sinal amplificado a partir de eletrodos de registro pode ser digitalizado usando outros conversores analógico-digital (por exemplo, MDS Analytical Technologies; Digidata 1440) antes que os dados digitalizada é gravados com software de aquisição de outros comercialmente disponíveis dados (por exemplo, MDS Analytical Technologies; Axoscope).

Parte 4: Estimular a sonda

1. A sonda estimulante é feito de uma pipeta de vidro (14 cm de comprimento) equipado com um par de eletrodos de fio fino. Dicas de eletrodos são expostos (0,2 mm) para produzir um sinal eletrônico quando o animal é tocado pela sonda. Esta permite medir o tempo exato de estimulação.
2. Saídas de sonda estimulantes são amplificados (1000x) por um amplificador extracelular (AM Sistemas; Modelo 1700). O sinal é filtrado usando uma combinação de baixa freqüência (<100 Hz) e alta freqüência de corte (> 5 kHz). O sinal é então ligado a uma caixa de comutação e uma placa de aquisição de dados (National Instruments). Dados digitalizados é gravado, armazenados e analisados ​​utilizando dados de aquisição de software (Ferramentas Photron Motion).

Parte 5: Gravações de vídeo

1. Uma câmera de vídeo de alta velocidade (FASTCAM-X 1280 PCI, Photron) é posicionado perpendicular à câmara de gravação para fornecer uma visão lateral. Nível de luminosidade no interior da câmara de gravação deve ser ajustado para fornecer os melhores resultados, por exemplo, utilizando um iluminador pescoço de ganso ou de outras fontes de luz focusable.
2. Videografia de alta velocidade é combinada e sincronizada com gravações eletrônicas utilizando uma caixa de breakout e placa de aquisição de dados (National Instruments). Sinal amplificado dos eletrodos de banho está ligado à caixa de breakout e placa de aquisição de dados usando cabos BNC. Um gatilho mão-switch externo inicia a aquisição sincronizada de vídeo e dados.

Parte 6: Procedimento Experimental

1. Um único animal é introduzido na câmara e permissão para se aclimatar por 5 minutos. Escapar tail-flips são eliciadas por torneiras único de intensidade diferente na cabeça ou no abdômen, respectivamente. A intensidade das torneiras é controlado pelo experimentador. Cada flip-cauda escapar é gravado com vídeo de alta velocidade a uma taxa de quadros de 1000 pontos f / s, e os dados de potenciais de campo eletrônicos são registrados em 25 kHz. Início do banho e gravação de vídeo é iniciada por interruptor manual em uma caixa de gatilho. Tempo de gravação é determinado pela taxa de quadros escolhido (por exemplo, 1000 m / s = 4 seg tempo de gravação total). Post-e horários pré-acionar a gravação pode ser selecionada.
2. Nãoe: gravações eletrodo Bath deve ser verificado uma vez para cada espécie testada através da combinação de gravações eletrodo banho com outros métodos disponíveis gravações. Em lagostas, um par de eletrodos de prata pode ser implantado cirurgicamente ao redor do cordão nervoso ventral. Estímulos provocando tail-flips de escape pode ser aplicada e registada traços eletrônicos de eletrodos implantados e banho podem ser comparados.
3. Escapar-flip tail comportamento e atividade neural correspondente pode ser gravado em uma variedade de contextos diferentes, por exemplo, em resposta a ameaças visual, durante os ataques de predadores, ou durante os encontros agonísticos de duas lagostas. Tamanho da câmara, modo de gravação, etc tem que ser ajustada em conformidade (ver Discussão).

Parte 7: A análise dos dados

1. Frames de vídeo simples são analisados ​​usando o software de movimento da ferramenta (Photron). Traços eletrônicos são usados ​​para identificar o tipo de circuito neural que foi ativado por cada estímulo. Dados de vídeo é comparado com gravações sincronizadas fisiológicos para determinar o movimento do animal e do circuito neural ativado. Cada circuito ativado produz uma assinatura característica electrónica (ver resultados Representante).
2. Latência entre a sonda de contato e de resposta neural / muscular são calculados para cada experimento, medindo a demora entre o início do sinal de sonda eo início do sinal gravado com os eletrodos de banho.

Parte 8: Resultados Representante

A única série de frames de vídeo de alta velocidade e correspondentes gravações de campo elétrico para fugir da cauda flip-em resposta a um estímulo tátil entregue à cabeça ou a cauda de uma lagosta juvenil (Fig. 2).

Fig. 2A: estímulo tátil forte na cabeça evocado uma cauda flip-controlados pelo circuito medial gigante. O aumento registrado do neurônio gigante (asteriscos) ea deflexão grandes fásica que se segue permite a não-ambígua de identificação da cauda-flip como mediada pela atividade de neurônios gigantes. O movimento para trás mostra os traços de vídeo determina a identidade do circuito neural ativado (MG).

Fig. 2B: Rabo-flip mediada pelo circuito gigante laterais depois de um forte estímulo tátil foi aplicado à cauda. Movimento para cima e para frente visto no vídeo traços juntamente com o rastreamento eletrônico sincronizado exibindo o pico gigantes e os grandes, deflexão fásica inicial determina a identidade do circuito neural ativado (LG).

Fig. 2C: Rabo-flip controlado por não-gigante de circuitos. Um estímulo mais gradual tátil foi entregue ao tórax do animal. Enquanto o movimento capturado em vídeo não permite a identificação inequívoca do circuito ativado, a gravação eletrônica não possui um pico gigante e consiste em identificar desvios muito menores do circuito ativado (Non-G).

Fig. 3: medições de latência para os três tipos de fuga tail-flips. Tempo entre o contato da sonda e resposta fisiológica foi medido por sete animais. Gigante mediada tail-flips são eliciadas significativamente mais rápido do que os não-gigantes tail-flips.

Figura 1: Um exemplo de uma câmara de gravação utilizado em nossos experimentos para animais de 2,5-3,5 cm de comprimento total. Os eletrodos de banho são colados em lados opostos da câmara, enquanto o fio terra está ligado ao lado mais longo da câmara e perpendicular aos eletrodos banho.

Figura 2: quadros de vídeo é gravada em 1000 gravações m / seg e correspondentes eletrônicos para três diferentes tipos de estimulação.

A) Um forte estímulo tátil foi entregue para a cabeça do animal e provocou um gigante medial (MG) ​​mediada tail-flip. Seis vídeo-frames são exibidos à esquerda. Trace gravação da sonda utilizada para tocar o animal é mostrado em cinza, o ponto de contato é indicado pela seta preta. Trace gravação obtida com os eletrodos de banho é mostrado em azul. A inserção mostra o pico axônio pequeno gigante que precede a grandes deflexões fásica. Barras cinza correspondem aos quadros de vídeo, que figura na esquerda. O primeiro movimento notável da cauda do crustáceo, ocorreu no quadro n º 3, sete milésimos de segundo após o contato com a sonda.

B) Um forte estímulo tátil foi entregue para a cauda do animal e provocou um gigante lateral (LG) mediada tail-flip. Seis vídeo-frames são exibidos à esquerda. Trace gravação da sonda utilizada para tocar o animal é mostrado em cinza, o ponto de contato é indicado pela seta preta. Trace gravação obtida com aeletrodos banho é mostrado em vermelho. A inserção mostra o pico axônio pequeno gigante que precede a grandes deflexões fásica. Barras cinza correspondem aos quadros de vídeo, que figura na esquerda. O primeiro movimento notável da cauda do crustáceo, ocorreu no quadro n º 3, oito milésimos de segundo após o contato com a sonda.

C) Um estímulo fraco e gradual tátil foi entregue para a cabeça do animal e provocou um não-gigante (Non-G) mediada tail flip-. Oito vídeo-frames são exibidos à esquerda. Trace gravação da sonda utilizada para tocar o animal é mostrado em cinza, o ponto de contato é indicado pela seta preta. Trace gravação obtida com os eletrodos de banho é mostrado em preto. O traço não tem o potencial de pico gigante, as deflexões inicial grande e consiste em potenciais de amplitude muito menor. Luz barras cinzentas correspondem aos quadros de vídeo, que figura na esquerda. O primeiro movimento notável da cauda do crustáceo, ocorreu no quadro n º 6, 115 milésimos de segundo após o primeiro contacto com a sonda.

Figura 3: Medidas de resposta de latência de sete animais diferentes de ambos os sexos e tamanhos semelhantes (média ± comprimentos STDV: 3.2 cm ± 0,2 cm, medido a partir rostro até telson). MG (barra azul) e LG (vermelho bar) tail-flips têm latências de resposta significativamente mais curto do que rabo-flips mediada por Non-G circuito (barra preta). Médias e desvios-padrão são mostrados. Barras com a mesma letra não diferiram significativamente entre si (teste de Wilcoxon Signed Posição para comparação de pares, p <0,05).

Discussion

Não-invasivo gravações de atividade único neurônio ou ativação de circuitos neurais são difíceis de obter em animais desenfreada. O método descrito aqui fornece um meio para identificar padrões de ativação neurais subjacentes que ocorrem naturalmente comportamento.

No passado, nós utilizado com sucesso esta técnica para medir os padrões de atividade neural nos circuitos de escapar de lagostas juvenis durante a formação de hierarquias de dominação social ^1, durante os ataques de predadores naturais ² e, mais recentemente, em resposta a ameaças visuais ^3. Atualmente, usamos as gravações de banho sincronizado eletrodo e gravações de vídeo de alta velocidade para medir a importância dos movimentos de apêndices da cabeça durante a execução de comportamentos de fuga em lagostas.

Embora essa técnica só foi usada em dois diferentes espécies de invertebrados (camarões e libélulas) e em dois laboratórios diferentes ^4, parece provável que ele pode ser aplicado a sistemas de modelo animal, incluindo vertebrados, alguns dos quais são comportamentos aquáticos e expressar que são controladas por neurônios grandes. Por exemplo, as respostas de fuga rápida de peixes teleósteos muitos são controlados por células Mauthner, grandes neurônios identificáveis ^​​5. Comportamento de fuga mediada pelas células Mauthner tem recebido muita atenção na literatura e tem sido estudada em vários níveis de análise, ainda, há evidências crescentes de que as células do corpo Mauthner controle fica rápida em situações que não estão relacionados com fuga ^6,7. As evidências, no entanto, é principalmente derivado de comparação de variáveis ​​cinemáticas dos comportamentos e não a partir de medições diretas de Mauthner atividade das células. Pode ser viável a utilização de gravações eletrodo banho em combinação com alta velocidade de videografia para medir potenciais de campo gerado pelas células Mauthner ou associada a atividade muscular.

Além de seu valor científico, a técnica descrita aqui é também ideal para fins educativos (por exemplo, laboratórios de ensino de graduação), devido à sua simplicidade e inexpensiveness geral.